植物組織游離脯氨酸含量的測定.docx

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1、植物組織游離脯氨酸含量的測定原理植物在逆境條件下，游離脯氨酸便會大量積累，且積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)。因此，脯氨酸可作為植物抗逆性的一項生化指標(biāo)。采用磺基水楊酸提取植物體內(nèi)的游離脯氨酸，不僅大大減少了其他氨基酸的干擾，快速簡便，而且不受樣品狀態(tài)(干或鮮樣)限制。在酸性條件下，脯氨酸與茚三酮反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色縮合物，用甲苯萃取后，此縮合物在波長520nm處有一最大吸收峰。脯氨酸濃度的高低在一定范圍內(nèi)與其消光度成正比。材料、儀器設(shè)備及試劑1．材料植物葉片2．儀器設(shè)備分光光度計；水浴鍋：漏斗：大試管(20m1)；具塞刻度試管(20m1)注射器或滴管(5～lOml

2、)。3．試劑(1)3％磺基水楊酸溶液(2)甲苯；(3)2.5％酸性茚三酮顯色液：冰乙酸和6mo1.L-l磷酸以3:2混合，作為溶劑進(jìn)行配制，此液在4℃下2～3天有效；‘(4)脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取25mg脯氨酸，用蒸餾水溶解后定容至250ml，其濃度為100ug.mL-l。再取此液10ml，用蒸餾水稀釋至lOOml，即成10μg．mL-1的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。1．標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（1）取7支具塞刻度試管按表9.2-1加入各試劑。混勻后加玻璃球塞，在沸水中加熱40min。(2)取出冷卻后向各管加入5ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層后吸取甲苯層以0號管勻?qū)φ?/p>

3、在波長520nm下比色。（3）以消光值為縱坐標(biāo)，脯氨酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求線性回歸方程表9．2．1各試管中試劑加入量試管0123456脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(m1)00．20．40．81．21．62．0水(m1)21．81．61．20．80．40冰乙酸(m1)2222222茚三酮顯色液(m1)3333333樣品測定（1）脯氨酸提取：取不同處理的剪碎混勻植物葉片0．2～0．5g(干樣根據(jù)水分含量酌減)，分別置于大試管中，加入5m13％磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提10min。(2)取出試管，待冷卻至室溫后，吸取上清液2m1，加2m1冰乙酸和3

4、m1顯色液，于沸水浴中加熱40min，下步操作按標(biāo)準(zhǔn)曲線制做方法進(jìn)行甲苯萃取和比色（向各管加入5ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層后吸取甲苯層以0號管勻?qū)φ赵诓ㄩL520nm下比色）。(3)結(jié)果計算：從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出測定液中脯氨酸濃度脯氨酸含量的百分?jǐn)?shù)。脯氨酸[μg.g-1(干或鮮重)](C．V)·(a·W)－1式中：C一提取液中脯氨酸濃度(PS)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得：V－提取液總體積（ml）A---測定時所吸取得體積（ml）W-----樣品重（g）