植物組織MDA含量測定

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1、植物組織MDA含量測定一、目的要求1．掌握植物組織MDA含量測定的原理及具體測量步驟；2．深化理解MDA與逆境和衰老的關(guān)系，理解植物組織MDA含量測定的意義；3．了解膜脂過氧化、氧自由基和MDA形成的關(guān)系；4．能夠根據(jù)待測材料的具體情況設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟測定MDA含量；5．學(xué)習(xí)分光光度計(jì)，低溫離心機(jī)等儀器的使用方法。二、實(shí)驗(yàn)原理植物遭受逆境脅迫或衰老時，體內(nèi)會發(fā)生一系列生理生化變化，如核酸和蛋白質(zhì)含量下降、葉綠素降解、光合作用降低，活性氧平衡失調(diào)及內(nèi)源激素平衡失調(diào)等?；钚匝醮x失調(diào)直接導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧的大量積累，從而引發(fā)或加劇膜

2、脂過氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，嚴(yán)重時會導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡。膜脂過氧化的產(chǎn)物有二烯軛合物、脂類過氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷。因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA含量是一個常用指標(biāo)，可通過測定MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。MDA在高溫及酸性環(huán)境下可與2-硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)，產(chǎn)生紅棕色的產(chǎn)物3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮（Trimet—nine），又名三甲川，該物質(zhì)在

3、532nm處有最大光吸收，在600nm處有最小光吸收。由于TBA也可與其它物質(zhì)反應(yīng)，并在532nm處有吸收，為消除硫代巴比妥酸與其它物質(zhì)反應(yīng)的影響，同時測定600nm下的吸光度，利用532nm與600nm下的吸光度的差值計(jì)算MDA的濃度。即：A532－A600＝ε·C·L式中，A532和A600分別表示532nm和600nm處的吸光度值，C是MDA濃度，L為比色杯厚度，ε=155L·mmol-1·cm-1。TBAMDA3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮需要指出的是，植物組織中糖類物質(zhì)可能對MDA-TBA反應(yīng)有干擾作用?？捎孟?/p>

4、列公式消除由蔗糖引起的誤差。C（μmol·L-1）=6.45×(A532－A600)－0.56×A450三、材料與設(shè)備1．材料：四種菠菜樣品，即綠色和黃色葉片的高溫處理和室溫對照。2．儀器：(1)分光光度計(jì)；(2)冷凍離心機(jī)；（3）水浴鍋；(4)天平；(5)研缽；(6)剪刀；(7)5ml刻度離心管；(9)刻度試管(10ml)；(10)鑷子；(11)移液管(5ml、2ml、1ml)；（12）冰箱。3．藥品(1)0.05mol/LpH7.8磷酸鈉緩沖液；(2)5％三氯乙酸溶液：稱取5g三氯乙酸，先用少量蒸餾水溶解，然后定容到10

5、0ml；(3)0.5％的TBA溶液：稱取0.5g硫代巴比妥酸，用5％三氯乙酸溶解，定容至100ml。四、實(shí)驗(yàn)步驟1．MDA的提?。喝悠?.5g（W），加入2ml預(yù)冷的0.05mol/LpH7.8的磷酸緩沖液，冰浴研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到5ml刻度離心試管，將研缽用緩沖液洗凈，清洗液也移入離心管中，最后用緩沖液定容至5ml。4500rpm，4度，離心10min，上清液即為MDA提取液，測量提取液的體積（V）。2．MDA含量測定：吸2ml（V2）的提取液于刻度試管中（空白為2ml緩沖液），加入3ml0.5％的TBA溶液，將試管放入沸

6、水浴中煮沸10min（自試管內(nèi)溶液中出現(xiàn)小氣泡開始計(jì)時）。到時間后，立即將試管取出并放入冰浴中。4500rpm，4度，離心10min，取上清液并量其體積（V1）。上清液于532nm、600nm波長下測定吸光度。3．結(jié)果計(jì)算:MDA(nmol·g-1)＝6.452×(A532－A600)×式中，V1為反應(yīng)液總量（ml）；V2為反應(yīng)液中的提取液數(shù)量(ml)；V為提取液總量（ml）；W為植物樣品重量(g)。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告?樣品處理重復(fù)A532A600MDA含量（nmol·g-1）???????高溫處理1???綠葉2???3???平均

7、???標(biāo)準(zhǔn)差?????室溫對照1???2???3???平均???標(biāo)準(zhǔn)差????????黃葉??高溫處理1???2???3???平均???標(biāo)準(zhǔn)差?????室溫對照1???2???3???平均???標(biāo)準(zhǔn)差???六、思考題1．TBA為什么要溶解在三氯乙酸中？2．提取液與TBA的混合液為什么要加熱？為什么加熱時間又不能過長？3．為什么要測定反應(yīng)液在600nm下的吸光度？4．如果可溶性糖含量影響MDA含量的測定，你有什么辦法消除其影響？5．正常植物與衰老時相比丙二醛含量有什么變化，分析其原因。七、注意事項(xiàng)1．可溶性糖與TBA顯色反應(yīng)的

8、產(chǎn)物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm），當(dāng)植物處于干旱、高溫、低溫等逆境時可溶性糖含量會增高，必要時要排除可溶性糖的干擾。2．低濃度的鐵離子能增強(qiáng)MDA與TBA的顯色反應(yīng)，當(dāng)植物組織中鐵離子濃度過低時應(yīng)補(bǔ)充Fe3+（最終濃度為0.5nmol·L-1）。3．如待測液渾濁，可適當(dāng)增加