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《mda、sod含量測(cè)定》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、MDA和SOD的測(cè)定SOD活性測(cè)定(避光!)【實(shí)驗(yàn)用品和儀器】手套、稱量紙、電子天平、250ml燒杯*1、500ml燒杯*1、100ml燒杯*2、50ml燒杯*6、玻棒*10、膠頭滴管*4、200ml量筒*1、100ml量筒*1、1000ml容量瓶*3、100ml容量瓶*3,200ml棕色容量瓶*1、150ml容量瓶*1、恒溫水浴鍋、研缽*n、離心管*3n、10ml帶塞試管*(n+1)、瓷盤、黑色塑料袋、黑色硬紙?zhí)?、離心機(jī)、人工氣候箱、分光光度計(jì)、比色杯*4、5ml移液槍、1ml移液槍、槍頭、鑷子、廢液缸
2、、和10ml小燒杯*(n+7)(n表示要做的樣品數(shù),x表示分X組比色)【實(shí)驗(yàn)藥品】液氮、冰、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、甲硫氨酸、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、EDTA-Na2、核黃素、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)和去離子水【配制試劑】①50mmol/LpH7.8的磷酸緩沖溶液(PBS)(含0.1mmol/LEDTA)。(1)磷酸緩沖液(母液)配制:磷酸A:0.2MNa2HPO4·12H2O:71.64g加水1000ml;磷酸B:0.2MNaH2PO4·2H2O:31
3、.21g加水1000ml。(2)磷酸A228.75ml+磷酸B21.25ml,加入EDTA-Na20.0372g;加水定容至1000ml。②220mmol/L甲硫氨酸:稱甲硫氨酸3.2824g,用50mmol/LpH7.8PBS溶解定容至100ml(現(xiàn)用現(xiàn)配)。③1.25mmol/L氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT):稱NBT0.1022g,用50mmol/LpH7.8PBS溶解定容至100ml避光保存。(現(xiàn)配現(xiàn)用)(稱取時(shí)NBT的重量在0.102g-0.1025g之間均可,最好0.1022g)⑤0.033mmo
4、l/L核黃素:稱0.00252g用PBS溶解定容至200ml。(稱取時(shí)核黃素的重量在0.0025g-0.0026g之間均可,最好0.0025g)低溫避光保存,即用黑紙將裝有該溶液的棕色瓶包好,三天內(nèi)有效。(現(xiàn)配現(xiàn)用)【SOD提取】(1)將鮮葉剪碎混勻,稱取0.5g(3份),放在研缽中,先用液氮研磨葉片,磨碎后加2mlPH7.8的PBS,研磨后轉(zhuǎn)移進(jìn)離心管,加2+1ml清洗研缽。(2)4℃下10000r/min離心15min,上清液為樣品提取液。放在冰上避光保存。【SOD活性測(cè)定】①取5ml或10ml小燒杯
5、N+6只,N表示測(cè)定樣品數(shù),另外6只為對(duì)照,其中CK(小燒杯放在大托盤中,盤里放冰):一個(gè)黑暗(空白對(duì)照);一個(gè)照光;(為保證測(cè)定,黑暗和照光都3個(gè)重復(fù)比較好)(不加酶液,以緩沖液代替)②按照下表加入各溶液(加試劑前確認(rèn)關(guān)燈,過程必須避光,在使用核黃素前必須避光)試劑管號(hào)最終濃度0-暗(暗對(duì)照管)0-光(光對(duì)照管)1(樣品,3重復(fù))磷酸緩沖溶液/ml4.14.14.05甲硫氨酸/ml0.30.30.313mmol/L氯化硝基四唑藍(lán)/ml0.30.30.375μmol/L核黃素/ml0.30.30.32.0
6、μmol/L酶液/ml000.05CK用PBS液代替總體積5.05.05.0①將上述試劑混勻后,0-暗對(duì)照燒杯置于暗處(加入核黃素立刻用雙層黑色硬紙?zhí)渍诠猓日{(diào)好人工氣候箱的溫度和光照再把0-光對(duì)照燒杯和樣品一起置于4000xl日光燈下反應(yīng)20min(要求各管受光一致,反應(yīng)溫度控制在25-35℃之間,溫度高時(shí)時(shí)間縮短,溫度低時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng),視光下對(duì)照管的反應(yīng)顏色和酶活性的高低適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)時(shí)間)。②反應(yīng)結(jié)束后,用黑布罩遮蓋小燒杯終止反應(yīng),以0-暗對(duì)照管做空白,在560nm處測(cè)定吸光度值?!居?jì)算】SOD活性=
7、〔(ACK-AE)*V/ACK〕*0.5*W*VtACK:照光CK吸收值A(chǔ)E:樣品管吸收值V:樣液總體積W:樣品鮮重Vt:測(cè)定時(shí)樣品用量SOD比活力=SOD總活力/蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量單位為mg/gMDA含量測(cè)定(避光!)【配制試劑】①50mmol/LpH7.8的磷酸緩沖溶液(PBS)②20%三氯乙酸(TCA):稱20g三氯乙酸,用蒸餾水溶解并定容至100ml??煞Q30g三氯乙酸,用蒸餾水溶解并定容至150ml。③0.5%硫代巴比妥酸(TBA):稱0.5g硫代巴比妥酸,用20%TCA溶解并定容至100ml
8、?!綧DA的提取】同SOD【MDA含量的測(cè)定】取上清液1.5ml于10ml帶塞試管中(對(duì)照管以1.5ml蒸餾水代替提取液還是PH7.8PBS),加入0.5%TBA2.5ml,混合后于沸水浴上反應(yīng)20min,迅速冷卻后在3000r/min下離心15min,上清液分別于450nm、532nm和600nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值?!居?jì)算】MDA濃度C(μmol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450