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《mda、sod含量測(cè)定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、MDA和SOD的測(cè)定SOD活性測(cè)定(避光！)【實(shí)驗(yàn)用品和儀器】手套、稱量紙、電子天平、250ml燒杯*1、500ml燒杯*1、100ml燒杯*2、50ml燒杯*6、玻棒*10、膠頭滴管*4、200ml量筒*1、100ml量筒*1、1000ml容量瓶*3、100ml容量瓶*3，200ml棕色容量瓶*1、150ml容量瓶*1、恒溫水浴鍋、研缽*n、離心管*3n、10ml帶塞試管*（n+1）、瓷盤、黑色塑料袋、黑色硬紙?zhí)?、離心機(jī)、人工氣候箱、分光光度計(jì)、比色杯*4、5ml移液槍、1ml移液槍、槍頭、鑷子、廢液缸
2、、和10ml小燒杯*（n+7）（n表示要做的樣品數(shù)，x表示分X組比色）【實(shí)驗(yàn)藥品】液氮、冰、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、甲硫氨酸、氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）、EDTA-Na2、核黃素、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）和去離子水【配制試劑】①50mmol/LpH7.8的磷酸緩沖溶液（PBS）（含0.1mmol/LEDTA）。（1）磷酸緩沖液（母液）配制：磷酸A：0.2MNa2HPO4·12H2O：71.64g加水1000ml；磷酸B：0.2MNaH2PO4·2H2O：31
3、.21g加水1000ml。（2）磷酸A228.75ml+磷酸B21.25ml，加入EDTA-Na20.0372g；加水定容至1000ml。②220mmol/L甲硫氨酸：稱甲硫氨酸3.2824g，用50mmol/LpH7.8PBS溶解定容至100ml（現(xiàn)用現(xiàn)配）。③1.25mmol/L氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）：稱NBT0.1022g，用50mmol/LpH7.8PBS溶解定容至100ml避光保存。（現(xiàn)配現(xiàn)用）（稱取時(shí)NBT的重量在0.102g-0.1025g之間均可，最好0.1022g）⑤0.033mmo
4、l/L核黃素：稱0.00252g用PBS溶解定容至200ml。（稱取時(shí)核黃素的重量在0.0025g-0.0026g之間均可，最好0.0025g）低溫避光保存，即用黑紙將裝有該溶液的棕色瓶包好，三天內(nèi)有效。（現(xiàn)配現(xiàn)用）【SOD提取】（1）將鮮葉剪碎混勻，稱取0.5g（3份），放在研缽中，先用液氮研磨葉片，磨碎后加2mlPH7.8的PBS，研磨后轉(zhuǎn)移進(jìn)離心管，加2+1ml清洗研缽。（2）4℃下10000r/min離心15min，上清液為樣品提取液。放在冰上避光保存。【SOD活性測(cè)定】①取5ml或10ml小燒杯
5、N+6只，N表示測(cè)定樣品數(shù)，另外6只為對(duì)照，其中CK（小燒杯放在大托盤中，盤里放冰）：一個(gè)黑暗（空白對(duì)照）；一個(gè)照光；（為保證測(cè)定，黑暗和照光都3個(gè)重復(fù)比較好）（不加酶液，以緩沖液代替）②按照下表加入各溶液（加試劑前確認(rèn)關(guān)燈，過程必須避光，在使用核黃素前必須避光）試劑管號(hào)最終濃度0-暗（暗對(duì)照管）0-光（光對(duì)照管）1（樣品，3重復(fù)）磷酸緩沖溶液/ml4.14.14.05甲硫氨酸/ml0.30.30.313mmol/L氯化硝基四唑藍(lán)/ml0.30.30.375μmol/L核黃素/ml0.30.30.32.0
6、μmol/L酶液/ml000.05CK用PBS液代替總體積5.05.05.0①將上述試劑混勻后，0-暗對(duì)照燒杯置于暗處（加入核黃素立刻用雙層黑色硬紙?zhí)渍诠猓日{(diào)好人工氣候箱的溫度和光照再把0-光對(duì)照燒杯和樣品一起置于4000xl日光燈下反應(yīng)20min（要求各管受光一致，反應(yīng)溫度控制在25-35℃之間，溫度高時(shí)時(shí)間縮短，溫度低時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)，視光下對(duì)照管的反應(yīng)顏色和酶活性的高低適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)時(shí)間）。②反應(yīng)結(jié)束后，用黑布罩遮蓋小燒杯終止反應(yīng)，以0-暗對(duì)照管做空白，在560nm處測(cè)定吸光度值?！居?jì)算】SOD活性=
7、〔（ACK-AE）*V/ACK〕*0.5*W*VtACK：照光CK吸收值A(chǔ)E：樣品管吸收值V：樣液總體積W：樣品鮮重Vt:測(cè)定時(shí)樣品用量SOD比活力=SOD總活力/蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量單位為mg/gMDA含量測(cè)定(避光！)【配制試劑】①50mmol/LpH7.8的磷酸緩沖溶液（PBS）②20%三氯乙酸（TCA）：稱20g三氯乙酸，用蒸餾水溶解并定容至100ml?？煞Q30g三氯乙酸，用蒸餾水溶解并定容至150ml。③0.5%硫代巴比妥酸（TBA）：稱0.5g硫代巴比妥酸，用20%TCA溶解并定容至100ml
8、?！綧DA的提取】同SOD【MDA含量的測(cè)定】取上清液1.5ml于10ml帶塞試管中（對(duì)照管以1.5ml蒸餾水代替提取液還是PH7.8PBS），加入0.5%TBA2.5ml，混合后于沸水浴上反應(yīng)20min，迅速冷卻后在3000r/min下離心15min，上清液分別于450nm、532nm和600nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值?！居?jì)算】MDA濃度C（μmol/L）=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450
