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《植物組織中SOD活性、MDA含量的測(cè)定方法.doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、植物組織中SOD活性的測(cè)定超氧物歧化酶（SOD）是需氧生物中普遍存在的一種含金屬酶。它與過氧化物酶、過氧化氫酶等酶協(xié)同作用防御活性氧或其他過氧化物自由基對(duì)細(xì)胞系統(tǒng)的傷害；SOD可以催化氧自由基的歧化反應(yīng)，生成過氧化氫、過氧化氫又可以被過氧化氫酶轉(zhuǎn)化成無害的分子氧和水。【原理】依據(jù)SOD抑制NBT在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化物存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧的條件下極易再氧化而產(chǎn)生02-，02-可將NBT還原為藍(lán)色的甲，后者在560nm處有最大吸收。而SOD作為氧自由基的清除劑可抑制此反應(yīng)。于是光還原反應(yīng)后，
2、反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明酶活性越低，反正酶活性越高。一個(gè)酶活單位定義為將NBT的還原抑制到對(duì)照一半（50%）時(shí)所需的酶量。【儀器與用具】離心機(jī)；分光光度計(jì)；進(jìn)樣器；紫光燈（4000Lx）；15mm×150mm試管；黑色硬質(zhì)套。【試劑】①0.05mol/L磷酸緩沖液PBS（pH=7.8）提取介質(zhì)50mmol/LPBS（pH=7.8）內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮②130mmol/L甲硫氨酸溶液：稱1.9397gMet，用PBS7.8進(jìn)行溶解并定容至100ml；③750umol/LNBT：稱0.06132gNBT，用PBS7.8進(jìn)行溶解并定容至100
3、ml，避光保存；④20umol/核黃素溶液：稱0.0075g核黃素，用蒸餾水溶解定容至1000ml，避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配；⑤100umol/L的EDTA-Na2溶液：稱0.0372gEDTA-Na2，用PBS7.8定容至1000ml?！痉椒ā?.酶液提取稱取植物葉片0.2g（去葉脈）于預(yù)冷的研缽中，加1ml預(yù)冷的提取介質(zhì)在冰浴下研磨成勻漿，加入提取介質(zhì)沖洗研缽，并使最終體積為2ml，于4℃、10000r/min離心15min，上清液即為SOD粗提液。2.顯示反應(yīng)取透明度好、質(zhì)地相同的15mm×150mm試管4支，2支為測(cè)定，2支為對(duì)照，
4、按下表加入試劑。混勻后，給1支對(duì)照管罩上比試管稍長的雙層黑色硬質(zhì)套遮光，與其他各管同時(shí)置于4000lx日光燈下反應(yīng)20-30min，反應(yīng)溫度控制在25-35℃試劑名稱用量(ml)終濃度(比色)0.05mol/LPBS溶液1.5130mmol/LMet溶液0.313mmol/L750umol/LNBT溶液0.375umol/L20umol/L核黃素溶液0.32umol/L100umol/LEDTA-Na2溶液0.310umol/L酶液0.1對(duì)照管用緩沖液0.1ml代替蒸餾水0.5總體積3.3【計(jì)算】以遮光的對(duì)照管作空白，將上述處理好的試
5、管在560nm處比色，采用如下進(jìn)行計(jì)算：SOD活性以每克鮮重酶單位表示其中，Ao——照光對(duì)照管的光吸收值；As——樣品管的光吸收值；Vt——樣品液總體積(ml)；V1——測(cè)定時(shí)樣品用品用量(ml)；FW——樣品鮮重(g)；植物組織中MDA含量和可溶性糖含量的測(cè)定【原理】MDA是常用的膜脂過氧化指標(biāo)，在酸性和高溫條件下，可與TBA反應(yīng)生成紅棕色的三甲川（3,3,5-三甲基惡唑-2,4-二酮），在532nm處有最大吸收。但是測(cè)定植物組織中MDA時(shí)受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的可溶性糖，糖與TBA顯示反應(yīng)產(chǎn)物在450nm處有最大吸收，在53
6、2nm也有吸收?！驹噭?0%TCA；0.6%TBA：先加少量的1mol/LNaOH溶解，再用10%的TCA定容；【方法】1.MDA提取稱取1g葉片，加2ml的10%TCA于研缽中研磨，然后再加8mlTCA繼續(xù)研磨，勻漿在4000r/min離心10min,上清液即為MDA粗液。2.顯示反應(yīng)取離心的上清夜2ml（對(duì)照用2ml蒸餾水代替），加入2ml0.6%TBA，混合后于沸水反應(yīng)15min,取上清夜測(cè)定450、532及600nm處的吸光度。【計(jì)算】①可溶性糖濃度（mmol/L）=11.71D450（糖含量套用下面公式③）②MDA濃度（u
7、mol/L）=6.45×(D532-D600)-0.56×D450③MDA含量（umol/g）=2MDA濃度（umol/L）×提取液體積（ml）/鮮重（g）/1000
