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《SOD、MDA、GSH》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、改良的鹽酸羥胺法測生物樣品SOD活性一．SOD（T-SOD）活力測定：原理：羥胺在有氧環(huán)境下發(fā)生自氧化可產(chǎn)生超氧陰離子，產(chǎn)生的超氧陰離子可由NBT還原率而檢測，在SOD存在下，超氧陰離子被分解，NBT還原被抑制。因此，用比色法測定NBT還原產(chǎn)物可以間接反映SOD的酶活力。儀器：可見光分光光度計(jì)試劑：75mMNa2CO3/NaHCO3緩沖液（pH=10.2，含0.15mMEDTA-Na2）5mMNH2OH·HCl0.3%（V/V）TritonX-1000.3ml0.98mMNBT0.1ml甲酸步驟：1.用1:5組織勻漿（血清可直接取樣），3000rpm離心30mi
2、n，取上清20ul稀釋至0.1ml2.按順序加入如下試劑：75mMNa2CO3/NaHCO3緩沖液2.0ml5mMNH2OH·HCl0.5ml0.3%（V/V）TritonX-1000.3ml0.98mMNBT0.1ml3.立即計(jì)時(shí)，于37℃恒溫水浴10min（避光）。4.2.0ml甲酸終止反應(yīng)。5.E560nM比色，記錄OD值。計(jì)算結(jié)果：酶單位表示：在本實(shí)驗(yàn)條件下，抑制率達(dá)50%所對應(yīng)的提取液SOD含量即一個(gè)SOD單位（U）?？捎妹縢蛋白（U/gprotein）表示。二．Mn-SOD活性測定：基于氰化物抑制CuZn-SOD非Mn-SOD活性的原理，在上述緩沖液
3、中加入KCN，使最終反應(yīng)體系中的KCN濃度達(dá)到2mM，即將緩沖液配成含3mM的KCN。37℃孵育45分鐘，以抑制CuZn-SOD。其余操作、步驟、計(jì)算方法同上。三．CuZn-SOD酶活力=T-SOD酶活力單位—Mn-SOD酶活力注意事項(xiàng)：1)對照組（非酶管）取樣品同體積的三蒸水，其余步驟同樣品。2)若測血中SOD，可取血清20ul，其余地操作步驟同上。來自：第四軍醫(yī)大學(xué)碩士王建宏學(xué)位論文《診斷劑量超聲對鼠胚胎和人絨毛脂質(zhì)過氧化及超微結(jié)構(gòu)的影響》。導(dǎo)師：錢蘊(yùn)秋。單位及專業(yè)：西京醫(yī)院超聲診斷科，超聲診斷學(xué)。1991.5-1992.6。參考秦緒軍、常耀明碩士論文原始參
4、考文獻(xiàn)：1、KonoY.Generationofsuperoxideradicalduringautoxidationofhydroxylamineandanassayforsuperoxidedismutase.ArchBiochemBiophys.1978Feb;186(1):189-95.或者YasuhisaKono.Generationofsuperoxideradicalduringautoxidationofhydroxylamineandanassayforsuperoxidedismutase.AnchivesofBiochemistryandB
5、iophysics.1978Feb;186(1):189-95.2、Yisunetal.FreeRadResComms1988;4:299-309.劉樹元制作2003-5-7熒光法測定血清脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（MDA）原理：過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛（簡稱MDA），可與硫代巴比妥酸（簡稱TBA）縮合，形成紅色產(chǎn)物。此紅色物質(zhì)在波長532nm有極大吸收峰，可用分光光度法進(jìn)行定量測定。若以515nm為激發(fā)光，則在553nm有最強(qiáng)熒光強(qiáng)度，故可用熒光法進(jìn)行微量測定。靈敏度高，再現(xiàn)性好，試樣用量少，是該方法的優(yōu)點(diǎn)。儀器：熒光分光光度計(jì)試劑：1)MDA標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1mmol/
6、L四乙氧基丙烷或四甲氧基丙烷水溶液）：準(zhǔn)確稱取22.03mg1，1，3，3-四乙氧基丙烷加水定容至100ml，放4℃冰箱，可保存三個(gè)月。2)MDA標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（1μmol/L）：準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1ml于100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，用時(shí)再準(zhǔn)確稀釋（現(xiàn)用現(xiàn)配）。3)1/24mol/LH2SO44)10%磷鎢酸溶液5)0.67％硫代巴比妥酸（TBA）：新鮮配制（溶于水與冰醋酸等體積混合液）。6)正丁醇（水飽和）步驟：血清樣品50μl1/24mol/LH2SO44.0ml10%磷鎢酸500μl混勻放置5min2000rpm離心10分鐘棄上清，空在濾紙上1/2
7、4mol/LH2SO42.0ml10%磷鎢酸300μl混勻放置5min，2000rpm離心5分鐘棄上清，空在濾紙上樣品管空白管標(biāo)準(zhǔn)管雙蒸水1.0ml(震1分鐘)1.0ml/標(biāo)準(zhǔn)品//1/0.5/0.25/0.125/0.0625各1.0ml0.67％TBA1.0ml1.0ml1.0ml振蕩、混勻100℃準(zhǔn)確水浴1h取出流水冷卻至室溫正丁醇（水飽和）4.0ml振蕩抽提1分鐘，2000rpm離心5分鐘取上清（正丁醇層）約3.0ml(若出現(xiàn)混濁，可加一滴無水乙醇)測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)光（515nm）發(fā)射光（553nm）計(jì)算結(jié)果：丙二醛濃度=0.5×1.00/0.05×1
8、.05/0.5×f/F=
