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《MDA含量測定的具體操作.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、MDA含量測定具體操作—TBA法（南京建成試劑盒，貨號：A003-1）一、實驗?zāi)康模簻y定樣品中MDA的含量（本實驗為23個小鼠肝組織10%的組織勻漿上清液樣本）二、實驗原理：MDA和TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收峰實驗材料三、儀器：a)全波長酶標(biāo)儀、離心機、渦旋混勻器、水浴鍋或者電爐、96孔板、玻璃試管、2ml的EP管，保鮮膜，橡皮筋、標(biāo)記筆、（ps:原本試劑盒是用紫外分分光光度計來進行測量，為了加快分析速度和節(jié)約試劑的成本，具體實驗中使用了全波長的酶標(biāo)儀）b)試劑：MDA試劑盒、待測樣品、無水乙醇、冰醋酸、雙蒸水四、實驗步驟a)試劑一從冰箱中取出，放置常溫至澄清后，
2、吸取2ml,備用b)本實驗中需要使用試劑二應(yīng)用液22.5ml,實際配制中取試劑二0.9ml,加入雙蒸水25.5ml，即配制了26.4ml的試劑二應(yīng)用液c)將之前配制好的試劑三，取出8ml的量（試劑三配制的過程中，需要加入熱的雙蒸水，在溶解過程中不斷加熱，根據(jù)試劑盒上說明的要求進行配制，保存的時候注意避光）d)標(biāo)記好25個小的玻璃試管，按順序放好；準(zhǔn)備好200ul和1000ul的移液器槍頭e)將各10%的肝組織勻漿上清液從冰箱中取出，融凍，備用；f)將處理后的樣品按照下面的操作表，將200ul量程的移液器調(diào)至60ul,（如果樣本沒有出現(xiàn)溶血的現(xiàn)象時，可以用空白管代替對照管）ul空白管標(biāo)準(zhǔn)管
3、測定管對照管標(biāo)準(zhǔn)品60無水乙醇60測試樣品6060試劑一60606060g)待樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加完以后，使用渦旋混勻器混勻ul空白管標(biāo)準(zhǔn)管測定管對照管試劑二應(yīng)用液300300300300試劑三應(yīng)用液30030030050%冰醋酸300h)渦旋混勻器混勻，試管口使用保鮮膜橡皮筋扎緊，用針頭刺小孔，將玻璃試管5,6個分別扎在一起，防止后續(xù)試驗傾倒。i)準(zhǔn)備1000ml的大燒杯，加入一定量的水，在電爐上開始加熱，在水中加入沸石，防止在加熱的過程中暴沸，試管的標(biāo)記要清楚，不易在煮沸過程中磨損j)在煮沸的條件下，同一批次同時加熱在40-80min（MDA在實際的操作過程中顯色不是很明顯，因而延長加熱時
4、間）k)反應(yīng)完畢以后，取出玻璃試管，使用移液器移取1ml于2ml的EP管中進行離心，離心的條件為4000min,10min測定各管的吸光度。l)將離心完的反應(yīng)試劑液吸取200ul到96孔板當(dāng)中（加樣的時候，注意不要吸到沉淀以及在加樣過程中防止產(chǎn)生氣泡，影響吸光度的測量），a)將酶標(biāo)儀的波長調(diào)至532nm,測各個樣本的吸光度b)根據(jù)公式：待測樣品MDA=測定管OD值-空白管OD值標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值*標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷待測樣本蛋白濃度二、注意事項a)通常一批次的樣品空白和標(biāo)準(zhǔn)管只需要做1-2只；b)在實驗初期，因為樣品量少，采用過小的EP管加熱，但是在加熱過程中，蓋子基本彈開，因而仍采用玻
5、璃管進行加熱；c)MDA試劑盒的使用，顯色反應(yīng)不明顯，盡量提高勻漿的濃度和加熱的時間，使得顯色更加明顯；d)試劑二應(yīng)用液在配制的時候要注意，不要觸碰到，對皮膚的損害比較大；e)在煮沸的過程中，對樣品的標(biāo)簽損害比較大，要標(biāo)記好，免得煮沸完，找不到相對應(yīng)的樣品，白忙活了；f)如果使用紫外分光光度計進行測量的同仁，只需要把劑量調(diào)大，具體的操作無異。g)有些未提及的注意事項，結(jié)合試劑盒說明書，希望你的實驗做得順利
