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1、植物組織游離脯氨酸含量的測定（一）實驗原理?????植物在逆境條件下，游離脯氨酸便會大量積累，且積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)。因此，脯氨酸可作為植物抗逆性的一項生化指標(biāo)。?????采用磺基水楊酸提取植物體內(nèi)的游離脯氨酸，不僅大大減少了其他氨基酸的干擾，快速簡便，而且不受樣品狀態(tài)(干或鮮樣)限制。在酸性條件下，脯氨酸與茚三酮反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色縮合物，用甲苯萃取后，此縮合物在波長520nm處有一最大吸收峰。脯氨酸濃度的高低在一定范圍內(nèi)與其消光度成正比。?（二）實驗材料、儀器設(shè)備及試劑?1材料植物葉片?????2儀器設(shè)備?分光光度計，恒溫水浴鍋，漏
2、斗，具塞刻度試管(20ml)?，移液槍（1ml和5ml），5ml和1ml刻度試管，燒杯，吸水紙，玻璃棒，試管架，比色皿等。3試劑?(1)3％磺基水楊酸溶液?：萬分之一電子天平稱取3g磺基水楊酸，然后將稱好藥品溶于100ml蒸餾水中。????(2)甲苯?(3)2.5％酸性茚三酮顯色液：冰乙酸和6molL-l磷酸以3:2混合，作為溶劑進行配制，此液在4℃下2～3天有效（此步驟重要）。?稱取1.25g茚三酮放入燒杯中用混合液50ml放入70℃水浴鍋中溶解，冷卻。(4)脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取25mg脯氨酸，用蒸餾水溶解后定容至250ml，其濃度為
3、100ug/ml。再取此液10ml，用蒸餾水稀釋至100ml，即成10ug/ml的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。??三．實驗方法1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作?（1）取7支具塞刻度試管按表2加入各試劑?；靹蚝蠹硬Ａ蛉?，在沸水中加熱40min。試管號0123456脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液/ml00.20.40.81.21.62水/ml21.61.20.80.40.20冰乙酸/ml2222222茚三酮顯色液/ml3333333脯氨酸含量/μg0248121620（2）取出冷卻后向各管加入5ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層后吸取甲苯層以0號管作為對照在波長520nm下比色。
4、?（3）以消光值為縱坐標(biāo)，脯氨酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求線性回歸方程?。2樣品測定?????（1）脯氨酸提取：從-80℃冰箱中取出樣品，放入事先裝好液氮的保溫桶中。每個樣品均取0.2g左右，分別置于大試管中，加入5ml?3％磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提10min。?（2）取出試管，待冷卻至室溫后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml顯色液，于沸水浴中加熱40min，下步操作按標(biāo)準(zhǔn)曲線制做方法進行甲苯萃取和比色（向各管加入5ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層后吸取甲苯層以0號管作為對照在波長520nm下比
5、色）。??（3）結(jié)果計算：從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出測定液中脯氨酸濃度?脯氨酸含量的百分?jǐn)?shù)。?????脯氨酸[μg.g-1(干或鮮重)]=(C·V)·(a·W)－1????式中：C一提取液中脯氨酸濃度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得：???????????V?－?提取液總體積（ml）???????????A?---??測定時所吸取得體積（ml）???????????W-----?樣品重（g）數(shù)據(jù)統(tǒng)計表海拔處理編號吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率稀釋倍數(shù)提取液中脯氨酸含量C（ug）提取液總體積V（ml）測定時所吸取的體積a（ml）樣品重（W）脯氨酸含量ugg平均值2900CK11
6、1112113114PEG1211221231243000CK211212213214PEG2212222232243100CK311312313314PEG3213223233243258CK411412413414PEG4214224234243600CK511512513514PEG5215225235243600--1CK611612613614PEG6216226236243700CK711712713714PEG7217227237243800CK811812813814PEG8218228238243900CK91191291
7、3914PEG9219229239244000CK1011101210131014PEG10211022102310244100CK1111111211131114PEG11211122112311244200CK1211121212131214PEG1221122212231224
