脯氨酸含量的測定方法.doc

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1、植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測定一、原理磺基水楊酸對脯氨酸有特定反應(yīng)，當(dāng)用磺基水楊酸提取植物樣品時，脯氨酸便游離于磺基水楊酸溶液中。然后用酸性茚三酮加熱處理后，茚三酮與脯氨酸反應(yīng)，生成穩(wěn)定的紅色化合物，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下測定吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出脯氨酸的含量。二、儀器及試劑1.儀器：分光光度計；電子分析天平；離心機(jī)；10ml+2ml離心管；恒溫水浴鍋；2.試劑及配制：冰醋酸；甲苯。2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol·L－1磷酸(7ml磷酸+13ml蒸餾水)中，37度搖床

2、搖動溶解，貯于4℃冰箱中。3％磺基水楊酸配配制：3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml。1mg·ml-1脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)母液配制三、實驗步驟1.脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1.1取6支10ml離心管編號，按下表配制每管含量為0～25μg的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。試劑管號0123451mg·ml-1脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（ul）3%磺基水楊酸（ul）冰醋酸（ml）2.5﹪酸性茚三酮（ml）01000115995111099011159851120980112597511每管脯氨酸含量（μg）0510152025加入表中試劑后，標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測樣品一起置于沸水浴中加熱60min（注意管蓋需要壓住，不然會爆開揮發(fā)液體），

3、取出冷卻，各試管再加入2ml甲苯，振蕩30秒鐘，靜置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。1.2以甲苯溶液為空白對照，在520mm波長處測定吸光度（A）值。1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以1～5號管脯氨酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.樣品的測定2.1脯氨酸的提取液氮研磨樣品材料，稱取適當(dāng)重量樣品粉末（0.1-0.2g）于2ml離心管,然后向各管分別加入1.5ml3％的磺基水楊酸溶液，振蕩混勻。（注意：樣品一定要精確稱量并記錄）離心12000g，10min，上清液1ml移至新10ml離心管中。2.2測定加入1ml冰醋酸及1ml2.5﹪酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱60min，溶液即呈紅色。

4、冷卻后加入2ml甲苯，搖蕩30秒鐘，靜置片刻，用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液為空白對照，在520mm波長處測定吸光度（A）值。四、計算結(jié)果從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品測定液中脯氨酸的含量，按下公式計算樣品中脯氨酸含量：C*稀釋倍數(shù)*提取液總量（ml）脯氨酸含量（μg·g－1Fw）＝———————————————————樣品鮮重（g）×測定時提取液用量（ml）公式中：C---從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的脯氨酸含量（μg）;稀釋倍數(shù)（如果見樣品中甲苯紅色太深，可以吸取一定量的萃取液經(jīng)甲苯稀釋后再測量）;提取液總量---1.5ml，測定時提取液用量---1.5ml磺基水楊酸提取后吸取了

5、多少，一般吸取1ml。五、注意事項:1.?配置的酸性茚三酮溶液僅在24h內(nèi)穩(wěn)定，因此最好現(xiàn)用現(xiàn)配。2.?測量新樣品時，用甲苯?jīng)_洗比色杯。3.試劑添加次序不能出錯。4.記得稱量樣品鮮重