脯氨酸含量測定.doc

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1、脯氨酸含量測定在逆境條件下（旱、鹽堿、熱、冷、凍），植物體內(nèi)脯氨酸（proline，Pro）的含量顯著增加。植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸。因此測定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的生理指標(biāo)。另外，由于脯氨酸親水性極強(qiáng)，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過程，因而能降低冰點(diǎn)，有防止細(xì)胞脫水的作用。在低溫條件下，植物組織中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作為抗寒育種的生理指標(biāo)。一、原理用磺基水楊酸提取植物樣品時(shí)，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三

2、酮加熱處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出（或用回歸方程計(jì)算）脯氨酸的含量。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：待測植物（水稻、小麥、玉米、高粱、大豆等）葉片。（二）儀器設(shè)備：1.722型分光光度計(jì)；2.研缽；3.100ml小燒杯；4.容量瓶；5.大試管；6.普通試管；7.移液管；8.注射器；9.水浴鍋；10.漏斗；11.漏斗架；12.濾紙；13剪刀。（三）試劑1.酸性茚三酮溶液：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋

3、酸和20ml6mol/L磷酸（8ml85%磷酸定容至20ml）中，攪拌加熱（70℃水?。┤芙?，貯于（4度）冰箱中（2-3天有效）；2.3％磺基水楊酸：3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml；（密封避光）3.冰醋酸；4.甲苯。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1）在分析天平上精確稱取25mg（10mg）脯氨酸（-20度，現(xiàn)稀釋現(xiàn)用），倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，然后倒入250ml(100ml)容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液中每ml含脯氨酸100μg。取此液10ml稀釋至100ml,即成10ug/m

4、l脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。（2）各試管中試劑加入量：0123456標(biāo)準(zhǔn)脯氨酸量00.20.40.81.21.62.0蒸餾水21.81.61.20.80.40冰乙酸2222222酸性茚三酮2222222（3）取7支試管按上表加入各試劑，每管在沸水浴中加熱40min。（4）冷卻后各試管準(zhǔn)確加入5ml甲苯，振蕩30S，靜置10min，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。（5）用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液為空白對(duì)照，于520nm波長處進(jìn)行比色。（6）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸濃度（X）而變的

5、回歸方程式，再按回歸方程式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算2ml測定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。2.樣品的測定（1）脯氨酸的提取：準(zhǔn)確稱取不同處理的待測植物葉片各0.5g(0.2)，分別置大管中，然后向各管分別加入5ml3％的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取過程中要經(jīng)常搖動(dòng),使碎葉沉下去），冷卻至室溫后過濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液于另一干凈的帶玻塞試管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱40min，溶液即呈紅色。（3）冷卻后加入5ml甲苯，充分

6、搖蕩30S，靜置10min，(取上層液至10ml離心管中，在3000rpm下離心5min。)（4）用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對(duì)照，在分光光度計(jì)上520nm波長處比色，求得吸光度值。四、結(jié)果計(jì)算根據(jù)回歸方程計(jì)算出（或從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出）2ml測定液中脯氨酸的含量（Xμg/2ml），然后計(jì)算樣品中脯氨酸含量的百分?jǐn)?shù)。計(jì)算公式如下：單位鮮重樣品的脯氨酸含量（μg/g）＝[X×5/2]/樣重*106*100%備注：比色時(shí)留下空白，以便隨時(shí)調(diào)零(在用分光光度計(jì)測定時(shí)，若期間有段時(shí)間不用，重

7、新啟用時(shí)，應(yīng)重新調(diào)零）顯色反應(yīng)應(yīng)2小時(shí)內(nèi)測完，甲苯分層后盡量兩小時(shí)內(nèi)測完。