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《地高辛標(biāo)記核酸探針的標(biāo)記方法》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、地高辛標(biāo)記核酸探針的標(biāo)記方法核酸探針已被廣泛用于篩選重組克隆、基因多樣性的種性檢測和真菌種群內(nèi)及種群之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系評價。最早使用的放射性同位素標(biāo)記核酸探針具有敏感性高、特異性好、分辨力強的特點，但放射性同位素標(biāo)記也存在著一系列令人困擾的問題,如成本高、探針半衰期短、放射性物質(zhì)危害人體健康等。而且在進行放射性同位素標(biāo)記實驗時,需要有專門的實驗室及相應(yīng)的實驗保護設(shè)施，還需要由經(jīng)過培訓(xùn)的專業(yè)人員來操作,因而限制了在普通實驗室進行分子生物學(xué)實驗?！ 〗鼛啄臧l(fā)展起來的非放射性核酸探針大多通過酶促、光化學(xué)和化學(xué)手段摻入一種報
2、道基團,這種報道基團可通過高靈敏度的冷光、熒光或金屬沉淀等檢測系統(tǒng)檢測。另外,應(yīng)用pH電極或感應(yīng)器技術(shù)的電化學(xué)檢測系統(tǒng)也有報道。在這些檢測系統(tǒng)中,靈敏度最高的是生物素-親合素檢測系統(tǒng)和半抗原-抗半抗原地高辛檢測系統(tǒng)。由于生物樣品中常含有內(nèi)源性生物素及生物結(jié)合蛋白，生物素標(biāo)記的核酸探針會發(fā)生一些非特異性結(jié)合，從而影響實驗效果。與生物素-親合素系統(tǒng)同樣具有高靈敏度，卻減少了非特異性結(jié)合的地高辛檢測系統(tǒng)，已為人們所接受,并得到廣泛的應(yīng)用。地高辛(Digoxigenin,DIG)又稱異羥基洋地黃毒甙元，是一種類固醇半抗原分子
3、。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。采用人工方法可以將地高辛的線型間隔臂與dUTP連接起來,形成DIG-11-dUTP，通過隨機引物法或PCR法將其摻入到DNA探針中。RNA探針的標(biāo)記是使用噬菌體信息編碼的RNA聚合酶，通過體外轉(zhuǎn)錄將DIG-11-dUTP摻入到RNA探針中。寡核苷酸探針的標(biāo)記則是通過末端轉(zhuǎn)移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP或DIG-11-ddUTP尾巴。對于目的DNA或RNA來說，分子雜交后,雜交部分可通過ELISA實驗程序加以檢測，即加入一種結(jié)合有堿性磷酸酶的地高辛-特異性抗體，它與地高
4、辛半抗原分子形成酶聯(lián)抗體-半抗原(DIG)復(fù)合物，再加入相應(yīng)的顯色底物，使雜交部分得以顯示。1 地高辛標(biāo)記核酸探針的主要標(biāo)記方法1.1 DNA探針的標(biāo)記方法1.1.1 PCR摻入法 這種標(biāo)記方法是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在Taq酶的作用下，將DIG-11-dUTP摻入到新合成的DNA鏈中。以本法標(biāo)記的探針不但靈敏度高，產(chǎn)量也很高。少量的基因組DNA(1ng～50ng)便可直接通過PCR進行擴增、標(biāo)記。1.1.2 隨機引物法 用隨機引物法可將DIG-11-dUTP標(biāo)記于DNA鏈上。為得到最佳標(biāo)記效果，標(biāo)記前模板DNA需作線
5、性處理，而且至少要用苯酚-氯仿進行一次抽提，再用乙醇沉淀。100～10000堿基的模板鏈均可被有效地標(biāo)記，但大于10000堿基的模板鏈則需要在標(biāo)記前作限制酶切消化。處理好的模板加入隨機引物，按堿基互補原則，隨機引物與模板DNA退火后由Klenow片段從引物3'端延伸引物，便可將DIG-11-dUTP均勻摻入到新合成的DNA鏈中。1.1.3 切口平移法 切口平移法DNA探針技術(shù)快速簡便，且已非常成熟。先用適量的DNaseI在雙鏈DNA上打開若干個單鏈缺口，然后在E.coliDNA聚合酶I的5'-3'外切活性和聚合活性的
6、共同作用下，在缺口的5'端切除單鏈DNA序列，隨之由新合成的帶有地高辛標(biāo)記的脫氧核苷酸鏈取代。本法適用于環(huán)形DNA或大于1kbDNA片段的標(biāo)記。用于原位雜交的核酸探針，通過切口平移法標(biāo)記最為有效。因為此方法可通過控制DNaseI的酶活性得到適當(dāng)?shù)娜笨冢瑥亩玫介L度大小適宜的探針，而探針的大小是原位雜交的一個重要參數(shù)，足夠小的探針才可能穿透組織或細胞。1.2 寡核苷酸探針的標(biāo)記方法合成的寡核苷酸探針被廣泛應(yīng)用于篩選基因文庫、Southern印跡、Northern印跡、斑點印跡及原位雜交試驗。地高辛標(biāo)記寡核苷酸有三種方法
7、:3'末端標(biāo)記、5'末端標(biāo)記以及在探針3'端加上數(shù)個DIG-11-dUTP分子的尾巴(圖2)。1.2.1 3'末端標(biāo)記法 3'末端標(biāo)記法的主要特點是在每個合成的寡核苷酸(長度為14～100bp)的3'末端只添加一個地高辛殘基(DIG-ddUTP)。用此方法標(biāo)記寡核苷酸時,除末端轉(zhuǎn)移酶外,無需其它特別的寡核苷酸合成試劑,方便快捷。所合成的探針適合于要求探針具有較高的特異性而靈敏度一般的試驗,如Southern印跡、Northern印跡、斑點印跡及菌落P噬菌斑雜交實驗。1.2.2 5'末端標(biāo)記法 5'末端標(biāo)記法是通過化學(xué)
8、方法將地高辛標(biāo)記于寡核苷酸的5'末端。首先在5'末端連接上一個氨基連接臂殘基,將合成的寡核苷酸純化后,再使DIG-NHS與5'末端的氨基殘基發(fā)生共價結(jié)合,從而形成標(biāo)記探針。這類探針的一個主要優(yōu)點是其3'端在DNA合成反應(yīng)中充當(dāng)引物,使反應(yīng)產(chǎn)物得以標(biāo)記。1.2.3 3'末端加尾法 3'末端加尾法是由末端轉(zhuǎn)移酶在探針3'末端加上數(shù)個地高辛殘基的尾巴
