茜素紅染色預(yù)實(shí)驗(yàn)

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1、茜素紅染色成骨分化是干細(xì)胞的一個(gè)重要特性。在特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用一段時(shí)間后，干細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞，在細(xì)胞表面沉積鈣鹽，形成鈣結(jié)節(jié)。應(yīng)用茜素紅的復(fù)合物，可用于鑒定干細(xì)胞是否已成功向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^(guò)茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞成骨分化二．實(shí)驗(yàn)原理：1.成骨誘導(dǎo)的過(guò)程是使鈣離子能夠以鈣鹽的方式沉淀下來(lái)，即“鈣結(jié)節(jié)”，鑒定鈣結(jié)節(jié)的染色方法常用茜素紅染色法。2.茜素紅：茜素磺酸鈉，茜素S，茜素紅S，茜素胭脂紅，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉鹽。橙黃色或黃棕色粉末。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯和氯仿。1%水溶液

2、pH為2.15，其水溶液呈前黃褐色，加鹽酸后變?yōu)辄S色，加氫氧化鈉后則變成藍(lán)紫色。有刺激性。能與許多金屬離子生成有色化合物，能與鋯、釷、鋁、鈦及鈣發(fā)生顯色反應(yīng)。3.染色原理：茜素紅與鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生一種深紅色的帶色化合物，這樣成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞外面沉積的鈣結(jié)節(jié)也就被染成了深紅色。三．實(shí)驗(yàn)試劑及儀器1.試劑：PBS10%甲醛緩沖液0.1%茜素紅-Tris-HCL染液蒸餾水2.儀器：倒置顯微鏡四．實(shí)驗(yàn)步驟1.棄培養(yǎng)液，PBS沖洗2次2.10%甲醛緩沖液固定10min3.蒸餾水沖洗3次4.加入0.1%茜素紅-Tris-HCL染液（pH8.3）,3

3、7℃下染色30min5.蒸餾水沖洗6.在倒置顯微鏡下觀察有無(wú)茜素紅染色陽(yáng)性細(xì)胞五．實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論RT-PCR檢測(cè)PPARγmRNA表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)?zāi)康模憾繖z測(cè)干細(xì)胞中PPARγmRNA的表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)原理：1.由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）稱(chēng)作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴(lài)RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來(lái)完成。隨后，DNA的另一條鏈通過(guò)脫氧核苷酸引物和依賴(lài)DNA的DNA聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互補(bǔ)DNA。2.RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNA。RT

4、-PCR廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測(cè)某種RNA的含量。檢測(cè)基因表達(dá)的方法，參見(jiàn)NorthernBlot法。3.RT-PCR的關(guān)鍵步驟是在RNA的反轉(zhuǎn)錄，要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。藥品及耗材：凝膠電泳檢測(cè)設(shè)備PCR儀實(shí)驗(yàn)方法：1.采用TRIzol提取總RNA，并用凝膠電泳檢測(cè)RNA含量。1.取1μg總RNA，用隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。2.94℃，變性40s3.48℃退火30s4.72℃延伸40s5.擴(kuò)增目的基因共循環(huán)反應(yīng)35次，末次結(jié)束循環(huán)6.72℃再延長(zhǎng)反應(yīng)10min7.擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%

5、瓊脂糖凝膠電泳8.使用Gelpro凝膠成像突向分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析9.用PPARγ的吸光度與GAPDH的吸光度比值表示PPARγmRNA的相對(duì)含量