卵巢癌早期診斷和篩選

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1、iTRAQ技術(shù)對卵巢癌早期篩查/診斷的蛋白質(zhì)磷酸化修飾的研究卵巢癌的研究現(xiàn)狀目前最普遍使用的卵巢癌生物標(biāo)記物是腫瘤抗原CA125,盡管80%的晚期卵巢癌病人CA125濃度不正常,但是50%～60%的Ⅰ期卵巢癌病人CA125濃度增高。CA125作為標(biāo)記物的陽性預(yù)測值不到10%。因此,需要尋找特異性更強(qiáng)和靈敏度更高的腫瘤分子標(biāo)記物。蛋白質(zhì)組學(xué)的新進(jìn)展盡管人類基因組包含了機(jī)體的所有遺傳信息,但其只是指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，而構(gòu)成細(xì)胞并發(fā)揮各種功能作用則是由蛋白質(zhì)來完成，蛋白質(zhì)還是機(jī)體多種不同類型細(xì)胞之間差異的決定因素。同樣,腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)

2、胞的差異在很大程度上也是由功能基因及其指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)組的不同來決定的。因此，有必要從蛋白質(zhì)組水平來揭示腫瘤的發(fā)生機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)可全面、動態(tài)、定量地分析比較正常與癌變標(biāo)本中蛋白質(zhì)種類和數(shù)量的改變,不僅有助于腫瘤發(fā)病機(jī)制的闡明,還能篩選和鑒定蛋白質(zhì)特異性標(biāo)記和特異性抗原,在腫瘤的早期診斷、治療和新藥研制方面,具有廣闊的應(yīng)用前景。研究背景蛋白質(zhì)的磷酸化修飾蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是生物體內(nèi)重要的共價(jià)修飾方式之一是生物界最普遍也是最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾。磷酸化的失調(diào)會導(dǎo)致很多嚴(yán)重的人類疾病，如癌癥。磷酸化蛋白質(zhì)檢測技術(shù)用于卵巢癌研

3、究中，有利于尋找卵巢癌診斷和治療的靶點(diǎn)。目前，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)在定量研究方面多采用32P代謝標(biāo)記、熒光染料染色的磷酸化蛋白質(zhì)定量分析方法、同位素標(biāo)記技術(shù)等。對于圖譜創(chuàng)建中許多磷酸化調(diào)控蛋白呈低豐度狀況,蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)敏感性的提高將是克服這一障礙的關(guān)鍵。隨著樣本制備技術(shù)和儀器設(shè)備的迅速發(fā)展,更好的富集策略和磷酸化定量兩大難點(diǎn)將會不斷得到克服,蛋白磷酸化位點(diǎn)的鑒定和定位技術(shù)也更易開展穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)在定量準(zhǔn)確度和規(guī)?；糠治龇矫娑加泻艽蟮膽?yīng)用前景。這種方法既可以研究全蛋白質(zhì)組的變化,也可以結(jié)合磷酸化肽段的富集技術(shù)和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

4、對磷酸化肽段進(jìn)行定量研究。目前,可用于肽段定量研究的iTRAQ、iCAT等技術(shù)同樣可用于磷酸化肽段的研究。研究背景研究背景我們?yōu)槭裁催x擇iTRAQ技術(shù)？iTRAQ技術(shù)是一種新的、功能強(qiáng)大的可同時(shí)對多種樣品進(jìn)行絕對和相對定量研究的方法，可以標(biāo)記生物樣品中產(chǎn)生的所有肽段，增強(qiáng)任一給定蛋白的肽段覆蓋度，同時(shí)保留了諸如一些蛋白的翻譯后修飾的重要結(jié)構(gòu)信息，可以實(shí)現(xiàn)在二級圖譜上的定量，具體原理已有詳細(xì)報(bào)道，但目前有關(guān)iTRAQ在磷酸化蛋白質(zhì)定量方面的研究報(bào)道還很少。這種方法是建立在iTRAQ試劑的基礎(chǔ)上。iTRAQ實(shí)際上是一種同位素標(biāo)記試

5、劑包括一個(gè)帶電荷的報(bào)告基團(tuán)，另外還有一個(gè)肽段反應(yīng)基團(tuán)和一個(gè)平衡基團(tuán)。主要觀點(diǎn)和創(chuàng)新之處目前，國內(nèi)外對于卵巢癌的早期篩查/診斷尚缺乏有效方法和特異性的腫瘤標(biāo)志物。我們本次實(shí)驗(yàn)意在通過對卵巢癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究，或得出正常卵巢和癌變卵巢表達(dá)蛋白的差異?；趇TRAQ+蛋白組學(xué)研究+蛋白磷酸化修飾的差異基于iTRAQ標(biāo)記結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)篩選卵巢癌血清標(biāo)記物在國內(nèi)雖有學(xué)者研究，但還沒有突破性的成果。我們發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外尚無學(xué)者研究卵巢癌表達(dá)蛋白磷酸化修飾的差異，我們此次通過研究卵巢癌表達(dá)蛋白磷酸化修飾的差異或得出正常卵巢和癌變卵巢表達(dá)蛋白的磷酸化修

6、飾是否存在差異。從而尋找用于卵巢癌早期診斷的血清腫瘤標(biāo)志物提供了一定的臨床前期研究基礎(chǔ)。之所以選擇磷酸化修飾作為研究對象，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)磷酸化是最常見，也是最重要的一種蛋白翻譯后修飾方式。蛋白質(zhì)的磷酸化在真核生物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有很重要的作用?；舅悸泛头椒P(guān)注新浪微博jdpptor@經(jīng)典PPT基本思路和方法1、血清來源:選取醫(yī)院經(jīng)病理證實(shí)為卵巢惡性腫瘤患者晨空腹血清20份，年齡33～70歲，設(shè)為卵巢癌組；經(jīng)體檢無任何疾病的健康人群晨空腹血清20份，設(shè)為正常對照組。所采集的血清標(biāo)本保存于-80℃冰箱；基本思路和方法2、血清差異蛋白

7、篩選：1）去除高豐度蛋白：每組樣品先取10例冰上解凍。等體積混合得到混合血清。從中取20μL，用緩沖液A各稀釋4倍。加入0.22μm的離心過濾器4℃16000g離心1min，去除血清中碎片成分。取稀釋血清80μL，進(jìn)行LC分離，流速0.125mL/min，在11～16min收集低豐度蛋白的流出組分。采用Bradord試劑盒檢測餾分蛋白濃度。其余樣本-80℃保存待用。2）蛋白定量標(biāo)記：1.2mL的預(yù)冷丙酮加入300μL低豐度蛋白血清，見沉淀物形成。4℃15000g離心100min，棄上清，沉淀室溫放置20min使丙酮揮發(fā)完全。然

8、后加入20μL溶解緩沖液充分混勻，使樣品充分溶解。每組樣品取100μg，加入2倍體積的還原劑，充分混合，60℃孵育1h。管內(nèi)加入半胱氨酸封閉劑渦旋混合后室溫孵育10min。按1∶30（胰酶∶蛋白質(zhì)）的比例向樣品管內(nèi)加入消化酶，渦旋混合，37℃孵育16h。iTRAQ試劑室溫凍融