酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)ELISA夾心法測定抗原ELISA間接法測定

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1、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）ELISA夾心法測定抗原ELISA間接法測定抗體原理及意義酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用結(jié)合起來的一種敏感性很高的新型免疫檢測技術(shù)。將已知抗原或抗體吸附在固相載體微孔聚苯乙烯塑料板上，通過抗原抗體特異性結(jié)合吸附待測樣品中的抗體或抗原后，加酶標(biāo)抗體（酶與抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體或抗原免疫反應(yīng)的特異性，又不影響酶本身的活性）和底物后，在相應(yīng)酶底物的作用下生成有色物質(zhì)，其顏色深淺

2、與標(biāo)記物中相應(yīng)的抗體或抗原的含量呈正比，由此可測定抗原或抗體的含量。常用的ELISA法有雙抗體夾心法測定抗原和間接法測定抗體。ELISA法雙抗體夾心法測定抗原1.原理一步法二步法常用試劑盒分一步法和二步法，二者原理完全相同。一步法將圖中的第2步和第3步同時進(jìn)行，允許混合加入，其形成的免疫復(fù)合物，基本不影響目測的結(jié)果，適用于目測結(jié)果。二步法如圖中第2步和第3步由于分步進(jìn)行，其結(jié)果較準(zhǔn)確，主要用于需要定量檢測時。2.材料（以測HBsAg為例）試劑：HBsAg診斷試劑盒器材：酶聯(lián)儀，微量加樣器，吸頭等3.方法加樣：每組7微孔，待檢4孔，空白對照1

3、孔，陰、陽性對照各1孔。分別加陰、陽性對照1滴和50ul待測樣本于相應(yīng)孔內(nèi)，置37℃水浴箱溫育30分鐘。加酶：除空白對照孔外，每孔加1滴酶標(biāo)溶液，混勻后封板，置37℃水浴箱溫育30分鐘。洗滌：用洗滌液（按說明配制）注滿各孔，靜置20秒，甩去洗滌液，重復(fù)4次，最后一次在吸水紙上拍干。顯色：每孔加底物液A、B各1滴（50ul），輕拍混勻，置37℃水浴15分鐘，肉眼觀察。終止：每孔加終止液1滴（50ul），輕拍混勻。4.結(jié)果測定用酶標(biāo)儀（450nm）測定各孔吸光度OD值（先用空白孔校零），P/N值≥2.1者判為HBsAg陽性，﹤2.1者判為陰性。

4、ELISA法間接法測定抗體1.原理2.材料（以測結(jié)核抗體為例）試劑：結(jié)核抗體診斷試劑盒器材：酶聯(lián)儀，微量加樣器，吸頭等3.方法包被抗原：在聚苯乙烯微量反應(yīng)板孔中加抗原100μl，4℃12－18小時。用1％BSA或正常兔血清4℃、12－18小時阻斷，4℃冰箱備用。洗滌：用前應(yīng)進(jìn)行漂洗去除雜蛋白，用洗滌液洗3次，每次3分鐘。加待測樣本：將血清稀釋成1：50，每份標(biāo)本加復(fù)孔，每孔100μl，37℃保溫30分鐘。設(shè)已知的陽性和陰性血清對照。洗滌3次后，加兔抗IgG酶結(jié)合物，37℃保溫30分鐘，以相同的方法洗滌3次。加新鮮配制的鄰苯二胺底物溶液和雙氧

5、水溶液各100μl。靜止20分鐘，再加入3mol/L硫酸每孔50μl終止反應(yīng)。4.結(jié)果測定肉眼觀察：白色背景上觀察四孔呈現(xiàn)的顏色反應(yīng)，與已知陽性和陰性孔比較。酶聯(lián)儀比色：酶聯(lián)儀用492nm測OD值。正常人血清OD﹤0.39，結(jié)核患者≥0.4。正常人存在著結(jié)核抗體，一般為0.2－0.39。兒童卡介苗接種和隱性結(jié)核菌感染時可﹥0.4，但患結(jié)核病結(jié)核抗體OD值≥0.6，為輕度升高。