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1、實(shí)驗(yàn)五1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)2.補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)免疫標(biāo)記技術(shù)定義:將抗原-抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合,用放射性同位素、酶或熒光素標(biāo)記的已知抗體或抗原,通過檢測(cè)標(biāo)記物,間接測(cè)定未知的抗原或抗體。分類:放射免疫測(cè)定法:131I,32P免疫熒光技術(shù):FITC,PE免疫酶測(cè)定法:HRP,AP免疫酶測(cè)定法(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶標(biāo)記的抗原或抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。辣根過氧化物酶(HRP),堿性磷酸酶(AP)特點(diǎn):高度特異性:保持抗原抗體反應(yīng)的特異性高
2、靈敏度:酶催化底物顯色的高效性,pg水平微量檢測(cè)定性定量檢測(cè):反應(yīng)液顏色深淺或光密度值分類:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn):可溶性抗原或抗體酶免疫組化法:組織中或細(xì)胞表面的抗原。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)用酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液體(血液、細(xì)胞液)中未知抗體或抗原的方法。1.定義2.分類間接法(IndirectELISA):將已知抗原吸附于固相載體,酶標(biāo)記二抗檢測(cè)液相中未知抗體雙抗體夾心法(SandwichELISA):將已知抗體吸附于固相載體,酶標(biāo)記一抗檢
3、測(cè)液相中的可溶性抗原競(jìng)爭(zhēng)法(CompetitiveELISA):將已知抗體或抗原吸附于固相載體,酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液相中的可溶性抗原或抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)3.原理(以間接性ELISA為例):顯色實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:間接法測(cè)定溶血素——定性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)材料脫纖維綿羊紅細(xì)胞——抗原兔抗綿羊紅細(xì)胞抗體(溶血素)——待測(cè)兔血清HRP標(biāo)記羊抗兔IgG——二抗包被緩沖液:0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液洗滌液:含0.05%Tween20的0.01MpH7.
4、4PBS底物緩沖液:pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液底物溶液:OPD10mg,底物緩沖液25ml,30%H2O240μL酶標(biāo)板,酶標(biāo)儀實(shí)驗(yàn)方法1.抗原的處理:脫纖維綿羊血加3mLN.S,混勻2000rpm,5min加3mLN.S,混勻2000rpm,5min取2mL壓積紅細(xì)胞加入2mL蒸餾水,震蕩破碎紅細(xì)胞用包被緩沖液稀釋成1:400備用2.包被抗原:取酶標(biāo)板,加入100μL/孔的抗原稀釋液4℃,濕盒內(nèi),18h取出包被好抗原的酶標(biāo)板(4孔/組),甩干孔內(nèi)液體以洗滌液(200μL/孔)洗滌3次,3min/次3.加待
5、測(cè)血清標(biāo)記各孔,加入相應(yīng)液體100μL/孔1234陰性空白陽性待測(cè)4.加二抗:37℃,濕盒內(nèi),30min甩干孔內(nèi)液體以洗滌液(200μL/孔)洗滌3次,3min/次各孔加入酶標(biāo)二抗100μL/孔37℃,濕盒內(nèi),30min5.顯色:甩干孔內(nèi)液體以洗滌液(200μL/孔)洗滌3次,3min/次加入底物溶液100μL/孔避光顯色,10min6.觀察結(jié)果實(shí)驗(yàn)方法預(yù)期結(jié)果陽性:顯色為黃色陰性:無色1234陰性陰性陽性陽性注意事項(xiàng)洗滌徹底,避免交叉污染。按順序加樣,孔底無氣泡。包被和溫育在濕盒內(nèi)進(jìn)行。2.補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)(C
6、omplementfixationTest,CFT)概念:補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng):是指在補(bǔ)體的參與下,以綿羊紅細(xì)胞(SRBC)和溶血素(抗SRBC的抗體)作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。補(bǔ)反中包括兩個(gè)系統(tǒng)五種成分:待檢系統(tǒng):已知Ag或Ab、待檢Ab或Ag及僅供一組Ag-Ab系統(tǒng)反應(yīng)的定量補(bǔ)體。指示系統(tǒng):綿羊紅細(xì)胞和溶血素。原理:待測(cè)系統(tǒng)抗原+未知血清12補(bǔ)體12Step1抗原抗體復(fù)合物的形成Step2補(bǔ)體的結(jié)合和耗竭指示系統(tǒng)SRBC+抗SRBC抗體Step3SRBC的裂解121:NoAb;2:AbAg待測(cè)血清Ab陽性NoA
7、b陰性AgAgAg抗原:傷寒菌裂解產(chǎn)物待測(cè)血清:56℃,30min補(bǔ)體:豚鼠血清2%綿羊紅細(xì)胞溶血素材料:方法:12345試驗(yàn)管血清對(duì)照管抗原對(duì)照管補(bǔ)體對(duì)照管SRBC對(duì)照管待測(cè)血清0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.4mL0.8mL抗原補(bǔ)體N.S搖勻,37℃,水浴15min溶血素SRBC0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL………………………………………………搖勻,37℃,水浴15min(1
8、份/2人)預(yù)期結(jié)果:1.管內(nèi)液體混濁呈淺紅色為不溶血,管內(nèi)液體透明呈紅色為溶血。溶血不溶血2.試驗(yàn)管血清對(duì)照管抗原對(duì)照管補(bǔ)體對(duì)照管SRBC對(duì)照管?溶血溶血溶血不溶血綿羊紅細(xì)胞用前應(yīng)輕晃混勻,不可劇烈震蕩。各種試劑的吸管不可混用。注意事項(xiàng):