培訓課件：酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)操作注意事項.ppt

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1、酶聯(lián)免疫吸附試驗操作注意事項酶免疫測定類型這種固相酶免疫測定方法在1971年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay），簡稱ELISA。酶免疫技術酶免疫組化酶免疫測定均相酶免疫測定非均相酶免疫測定固相酶免疫測定液相酶免疫測定ELISA原理（以一步法雙抗體夾心法測抗原為例）ELISA其原理為抗原抗體特異性結(jié)合和抗原抗體的酶標記，以酶催化底物顯色來判斷結(jié)果。影響酶聯(lián)免疫測定的因素較多,諸如標本的采集保存、試劑的準備、加樣的技術、孵育溫度的控制、洗滌反應板的方式、顯色反應時間的控制等一系列問題均有可能對試驗結(jié)果產(chǎn)生很大的影響

2、,只有避免了這些因素,才能保證試驗結(jié)果的準確性和可靠性。一、移液槍的使用1.樣品準備（1）吸樣之前要保證移液槍、槍頭和液體處于相同溫度。置于冰箱保存的樣品應提前取出，室溫放置，使溫度平衡后再吸樣。液體溫度>吸頭溫度的移取的液體體積會偏大液體溫度<吸頭溫度的移取的液體體積會偏?。?）若溶劑瓶中液體太少，可倒入EP管中，方便吸取。2.體積設定大體積?小體積逆時針精度最佳小體積?大體積順時針調(diào)至超過設定刻度，再回調(diào)可保證最佳的精確度嚴格的精確調(diào)節(jié)方法3.裝槍頭將移液槍端垂直插入吸頭，左右微微轉(zhuǎn)動，上緊即可上下敲擊會引起內(nèi)部的零部件因瞬間強烈撞擊而松散，甚至會導致調(diào)節(jié)刻度的旋鈕卡

3、住4.吸液（1）垂直吸液，槍頭吸嘴尖端需浸入液面2-4mm以下。（2）槍頭吸嘴預潤濕（2-3次），使吸嘴內(nèi)壁液體吸附達到飽和，再吸入樣液，最后打出液體的體積會很精確。一般液體，正向吸液（一檔?二檔）。粘稠液體和易揮發(fā)液體，可反相吸液（二檔?一檔）。正向吸液反向吸液（3）緩慢吸取，控制好彈簧的伸縮速度。吸液速度太快會產(chǎn)生反沖和氣泡，導致移液體積不準確和腐蝕槍體。（4）吸取后將移液槍提離液面，停約一秒鐘，觀察是否有液滴緩慢地流出。若有流出，說明有漏氣現(xiàn)象（原因有：槍頭未上緊；槍頭不匹配；移液槍內(nèi)部氣密性不好）。（5）吸嘴外壁殘留液滴可沿壁靠去或用濾紙蘸擦。5.放液（1）將吸嘴

4、口貼到容器內(nèi)壁并保持10-40°傾斜。（2）平穩(wěn)地把按鈕壓到一檔，停約一秒鐘?二檔，排出剩余液體。排放致密或粘稠液體時，壓到一檔后，再多等一兩秒鐘?二檔。（3）壓住按鈕，同時提起移液器，使吸嘴貼容器壁擦過。（4）松開按鈕。（5）按彈射器除去移液嘴。（6）使用完畢。移液槍的養(yǎng)護及注意事項吸取液體時一定要緩慢平穩(wěn)地松開拇指，絕不允許突然松開，以防溶液吸入過快而沖入槍體內(nèi)腐蝕柱塞造成漏氣。移液槍應輕拿輕放，不能將已吸有液體的移液槍平放或倒置，以免液體倒流腐蝕活塞彈簧。不得用移液槍移取有腐蝕性的溶液，如強酸、強堿等。如有液體進入槍體，應及時擦干。千萬不要將按鈕旋出量程，否則會卡住

5、內(nèi)部機械裝置而損壞移液槍。移液槍長時間不用時建議將刻度調(diào)至最大量程，讓彈簧恢復原形，保持松弛狀態(tài)，延長移液槍的使用壽命。應定期對移液槍進行校準。二、ELISA具體操作1標本的收集和保存2試劑的準備3加樣本及反應試劑4溫育5洗板6顯色7比色8結(jié)果判斷1標本的收集和保存樣品必須置冰箱中冷凍保存。待檢測時取出解凍待測。1標本的收集和保存（1）細菌生長所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；一些細菌的內(nèi)源性酶可對以相應酶作標記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。樣品在保存中如出現(xiàn)細菌污染所致的混濁或絮狀物時，應離心沉淀后取上清檢測。（2）冰凍保存的樣品須注意避免因停電等造成的反

6、復凍融。2試劑的準備試劑盒成分：常用的固相載體（ELISA板孔）材質(zhì)：聚苯乙烯、聚氯乙烯，具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值底，各板之間、同一板各孔之間性能相近。包被抗原或抗體與聚苯乙烯固相載體通過疏水基團作用物理吸附結(jié)合常用的酶：HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。洗液：非離子型洗滌劑酶反應的底物：H2O2，為受氫體；顯色劑：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS，為供氫體。終止液為硫酸。2試劑的準備（1）在實驗開始前，將試劑盒先從冰箱中取出，在室溫下放置30分鐘以上，再進行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是

7、為了縮短升溫時間，使反應孔內(nèi)的溫度能較快地達到所要求的高度，以滿足測定要求。（2）試劑盒中的洗滌液如需在使用時對所提供的濃縮液稀釋配制，稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應保證質(zhì)量。3加樣本及反應試劑在ELISA實驗中一般有3次加樣步驟，即加樣品、加酶結(jié)合物、加底物和顯色劑。加樣必須注意的關鍵點是：（1）加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣時如有氣泡，抗原抗體不能有效地結(jié)合會導致弱陽性甚至假陰性。（2）每次加樣品應更換吸頭，以免發(fā)生交叉污染。（3）加酶結(jié)合物、加底物，應使加液量準確均一、加液過程迅速完成。也可使