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《實驗四-酶聯(lián)免疫吸附試驗-ELISA課件.ppt》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、實驗四 阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗 （阻斷ELISA)免疫標(biāo)記技術(shù)定義：將抗原-抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，用放射性同位素、酶或熒光素標(biāo)記的已知抗體或抗原，通過檢測標(biāo)記物，間接測定未知的抗原或抗體。分類：放射免疫測定法：131I，32P免疫熒光技術(shù)：FITC，PE免疫酶測定法：HRP，AP免疫酶測定法(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶標(biāo)記的抗原或抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶(AP)特點：高度特異性：保持抗原抗體反應(yīng)的特異性高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性，pg水平微量檢測定性定量檢測：反應(yīng)液顏色深淺或光密度值分
2、類：酶聯(lián)免疫吸附試驗：可溶性抗原或抗體酶免疫組化法：組織中或細(xì)胞表面的抗原。酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)用酶標(biāo)記抗原或抗體檢測液體（血液、細(xì)胞液）中未知抗體或抗原的方法。1.定義2.原理（1）利用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接。（2）通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。3.常用種類直接法（directELISA）：將已知抗原直接吸附于載體，加酶標(biāo)抗體檢測抗體間接法（IndirectELISA）：將已知抗原吸附于固相載體，加酶標(biāo)記二抗檢測液相中
3、未知抗體雙抗體夾心法（SandwichELISA)：將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)記一抗檢測液相中的可溶性抗原競爭法（CompetitiveELISA)：將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記抗原或抗體檢測液相中的可溶性抗原或抗體阻斷法（BlockELISA)：將已知抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記單克隆抗體檢測液相中的可溶性抗體（1）?直接法測定抗原A.?????將抗原吸附在載體表面；B.?????加酶標(biāo)抗體，形成抗原—抗體復(fù)合物；C.加底物。底物的降解量＝抗原量。（2）間接法測定抗體A.?????將抗原吸附于固相載體表面；B.?????加抗體,形成抗原
4、-抗體復(fù)合物;C.?????加酶標(biāo)抗體；D.加底物。測定底物的降解量＝抗體量。（3）雙抗體夾心法測定抗原A.?????將抗體吸附于固相表面;B.?????加待檢抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物;C.????加酶標(biāo)抗體;E.加底物。底物的降解量＝抗原量。（4）競爭法測定抗原A.????將抗體吸附在固相載體表面;B.同時加入酶標(biāo)抗原和待測抗原，競爭結(jié)合抗體；對照只加入酶標(biāo)抗原；C.加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。（5）阻斷法測定抗體本法主要用于檢測型特異性抗體。該方法現(xiàn)已成為豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬偽狂犬?。≒R）及豬胸膜肺炎（AP）的主
5、要檢測方法。A.?將抗原吸附在固相載體表面;B.先加待檢血清（抗體）,形成抗原-抗體復(fù)合物;C.??再加酶標(biāo)單抗；D.加底物。酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)4.原理（以ELISA為例）：顯色酶標(biāo)單抗酶標(biāo)單抗實驗材料豬偽狂犬病毒（PRV）——抗原陰性對照陽性對照樣品——待測豬血清HRP標(biāo)記豬PRV單抗——酶標(biāo)單抗包被緩沖液：0.025MpH9.6碳酸鹽緩沖液洗滌液：含0.05%Tween20的0.01MpH7.4PBS底物緩沖液：pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液底物溶液：TMB（四甲基聯(lián)苯胺）
6、，底物緩沖液，30%H2O2，新鮮配制酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀阻斷法測定豬偽狂犬病病毒ELISA抗體——定性檢測實驗方法1.抗原的處理：2.包被抗原：取酶標(biāo)板，加入100μL/孔的抗原稀釋液4℃，濕盒內(nèi)，18h取出包被好抗原的酶標(biāo)板（4孔/組），甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次3.加待測血清標(biāo)記各孔，加入相應(yīng)液體100μL/孔1234陰性空白陽性待測4.加單抗：37℃，濕盒內(nèi)，30min甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次各孔加入酶標(biāo)單抗100μL/孔37℃，濕盒內(nèi)，30min5.顯色：甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（
7、200μL/孔）洗滌3次，3min/次加入底物溶液100μL/孔避光顯色，10min6.觀察結(jié)果實驗方法1、取已包被豬偽狂犬病毒抗原的酶標(biāo)板（根據(jù)樣品多少，可拆開分次使用），用樣品稀釋液（PBS）將待檢血清1∶1稀釋后加入板孔中，每孔加100μl。同樣1∶1稀釋陰、陽性對照血清，陰、陽性對照各設(shè)1孔，每孔100μl。另設(shè)一空白對照孔，空白對照孔加100μl稀釋液。輕輕振勻孔中樣品（勿溢出），置37℃溫育30分鐘。2、洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液200μl，靜置3分鐘倒掉，再在吸水紙上拍干，重復(fù)3次。3、每孔加酶標(biāo)單抗100μl，置3
8、7℃溫育30分鐘。4、洗板：洗滌3次（方法同步驟2）。切記每次在干吸水紙上拍干。5、顯色與終止：每孔先加底物
