人參皂苷Rg3對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞的凋亡作用及其活性研究

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1、人參皂昔Rg3對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞的凋亡作用及其活性研究人參皂昔Rg3對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞的凋亡作用及其活性研究人參是我國傳統(tǒng)中草藥，其有效化學(xué)成分為人參皂昔人參皂。人參皂貳Rg3是從中藥紅參中提取的有效成分，國內(nèi)外己有不少研究證實(shí)，人參皂玳Rg3具有抗腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用。立題依據(jù)：人參皂昔Rg3可以通過多種途徑來實(shí)現(xiàn)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。人參皂昔Rg3能通過Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來抑制某些癌癥的發(fā)生，也可以激活細(xì)胞周期素激酶抑制基因p21和p27的表達(dá)，使細(xì)胞停滯在G1期（參考文獻(xiàn)）。實(shí)驗(yàn)材料：1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠30只（雌雄各半），另選昆明種小鼠6只（雌雄各半

2、，供傳代用），每只重約20±2go于實(shí)驗(yàn)前一周購進(jìn)，飼養(yǎng)于安靜、溫暖、避強(qiáng)光的環(huán)境中，室溫20±5°C,自由攝食、飲水。2.動(dòng)物飼料普通顆粒飼料。3?細(xì)胞系小鼠肝癌細(xì)胞系H22,由當(dāng)?shù)貙?shí)驗(yàn)研究所提供。4.藥物人參皂試Rg3由市面上買得，純度96%o5.主要儀器微量注射器，小鼠實(shí)驗(yàn)板，手術(shù)器械，真空干燥箱，6.其他抗生素藥膏，安爾碘，0.5%氨水，生理鹽水，微孔過濾器。實(shí)驗(yàn)方法：1動(dòng)物分組從30只昆明種小鼠（雌雄各半）中按體重隨機(jī)分為3組，分別為正常對(duì)照組（10只），肝癌模型組仃0只），人參皂貳Rg3組（10只）。2造模2.1肝癌細(xì)胞株的傳代將小鼠1122肝癌細(xì)胞株

3、常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)擴(kuò)增，調(diào)整細(xì)胞懸液密度至1X106/ml,注入供傳代的昆明種小鼠腹腔1ml,—周后抽取腹水，以1200r/min的速度離心5min,棄上清，保留下層糊狀細(xì)胞漿備用。2.2小鼠移植性肝癌模型的制作昆明種小鼠術(shù)前禁食12h,10%水合氯醛0.35ml/100g劑量腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)板上，無菌條件下沿腹正中線切開lcm左右，暴露肝臟，托出肝左葉，用1ml注射器，抽取糊狀細(xì)胞漿,針頭與肝臟表面成30°斜刺入肝臟0.5cm,注入糊狀細(xì)胞漿0.05ml,拔出針頭,棉簽壓迫無滲血后遂層縫合關(guān)腹。2.3給藥方法造模24h后開始給藥，持續(xù)給藥10天。正常對(duì)

4、照組生理鹽水以0.2ml/只?天灌胃肝癌模型組生理鹽水以0.2迅/只?天灌胃日1次;日1次;人參皂貳Rg3組人參皂貳Rg3倍以5mg/kg?d灌胃實(shí)驗(yàn)步驟：1.腫瘤細(xì)胞懸液制備從傳代小鼠肝組織中癌性組織,加入4mlHanks液，1200r/min離心5min,重復(fù)洗滌3次后加入含10%小牛血清的DMEM(高糖)細(xì)胞培養(yǎng)基制成2HAC細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至IX10°個(gè)/ml備用。2.癌細(xì)胞的接種分別取肝癌模型組和人參皂昔Rg3組10只小鼠按下法進(jìn)行癌細(xì)胞接種：小鼠術(shù)前12h禁食，6h禁水，將小鼠腹腔麻醉后，取仰臥位，用橡皮筋固定四肢于實(shí)驗(yàn)板上，刮去腹部體毛，安爾碘

5、消毒后，剪開皮膚和腹膜，使肝左葉突出腹腔。用微量注射器抽取5PL2HAC細(xì)胞混懸液，針尖刺入小鼠肝臟注入細(xì)胞懸液，注入后拔出針頭，立即用75%酒精棉簽按壓針孔至肝臟表面不再滲血，隨即用少量粘合劑涂抹于針孔處，待干后用生理鹽水沖洗曝露的肝臟表面。將肝葉送回腹腔，縫合關(guān)腹。以75%酒精擦拭切口后，涂抹一層抗生素藥膏。3.人參皂昔Rg3的預(yù)處理將人參皂昔血3置于真空干燥箱(600。C)干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取已烘干的人參皂昔50g,備用。4.注射用液的制備表一不同濃度的人參皂昔Rg3溶液12345678910人參皂昔Rg3(mg)1001502002503003504004

6、50500550生理鹽水(ml)100100100100100100100100100100人參皂昔11.522.533.544.555.5Rg3濃度(mg/ml)5?動(dòng)物模型的設(shè)置將三組屮的每一只小鼠稱重標(biāo)號(hào)，按照表二設(shè)定的溶液給正常對(duì)照組和肝癌模型組注射生理鹽水，而人參皂昔超3組注射藥物劑量。表二各小鼠所注射的藥物量或生理鹽水的量12345678910正常對(duì)照組生理鹽水/ml敢愛模型組生理樸水/ml人參皂昔Rg3藥物/ml實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)處理:給藥10天后，采取斷頸處死齊組動(dòng)物，切取部分肝組織稱重記錄。表三各小鼠的肝臟重量12345678910正常對(duì)照組（g）肝

7、癌模型組（g）人參皂昔Rg3@）差值（g）1.將肝癌模型組和人參皂昔Rg3組切取肝腫瘤組織，縱向?qū)Ρ葍山M小鼠腫瘤組織的體積的大?。粰M向?qū)Ρ热藚⒃砦鬜g3組切取的腫瘤組織大小，得出初步結(jié)論：人參皂昔Rg3對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞有凋亡作用。2.繪制濃度-瘤重差曲線，確定藥物與濃度之間的關(guān)系和藥理相關(guān)藥物濃度。研究意義：（沒有作要求）從不同方向就人參皂昔Rg3抗腫瘤的作用機(jī)制進(jìn)行了更深入的研究，這將有利于人參皂背Rg3在臨床上更好的應(yīng)用，同時(shí)對(duì)抗腫瘤新藥的開發(fā)也具有重要的指導(dǎo)意義。