酶與細(xì)胞的固定化

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1、第二章酶與細(xì)胞的固定化引言酶是一類由生物細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化功能的蛋白質(zhì)。酶參與生物體內(nèi)的各種代謝反應(yīng),而且反應(yīng)后其數(shù)量和性質(zhì)不發(fā)生變化。高效率高度專一性可調(diào)控性反應(yīng)條件溫和廣泛應(yīng)用于釀造、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域酶對(duì)環(huán)境十分敏感物理因素：溫度、壓力、電磁場(chǎng)化學(xué)因素：氧化、還原、有機(jī)溶劑、金屬離子、離子強(qiáng)度、pH生物因素：酶修飾和酶降解反應(yīng)速度逐漸下降反應(yīng)后不能回收對(duì)于現(xiàn)代工業(yè)來(lái)說(shuō),酶還不是一種理想的催化劑怎樣才能獲得理想的生物催化劑?答案：固定化酶固定化細(xì)胞固定化酶與固定化細(xì)胞是酶工程研究中的一個(gè)廣闊領(lǐng)域，前景光明第一節(jié)酶的固定化固定化酶是指將水溶性的酶用物理或

2、化學(xué)方法處理，使之成為不溶于水的，但仍具有酶活性的酶。反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)使用。一、固定化酶的定義固定化酶的優(yōu)點(diǎn)①極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開(kāi);②可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng);③在大多數(shù)情況下,能夠提高酶的穩(wěn)定性;④酶反應(yīng)過(guò)程能夠加以嚴(yán)格控制;⑤產(chǎn)物溶液中沒(méi)有酶的殘留,簡(jiǎn)化了提純工藝;⑥較游離酶更適合于多酶反應(yīng);⑦可以增加產(chǎn)物的收率,提高產(chǎn)物的質(zhì)量;⑧酶的使用效率提高,成本降低。固定化酶存在的缺點(diǎn)①?固定化時(shí),酶活力有損失;②增加了生產(chǎn)的成本,工廠初始投資大;③只能用于可溶性底物,而且較適用于小分子底物,對(duì)大分子底物不適宜;④與完整

3、菌體相比不適宜于多酶反應(yīng),特別是需要輔助因子的反應(yīng);⑤胞內(nèi)酶必須經(jīng)過(guò)酶的分離手續(xù)。二、固定化酶的制備原則根據(jù)應(yīng)用目的、應(yīng)用環(huán)境，選擇固定化的方法，都要遵循以下基本原則：①必須注意維持酶的催化活性及專一性。②固定化應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化。③固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻④酶與載體必須結(jié)合牢固,從而使固定化酶能回收貯藏,利于反復(fù)使用。⑤固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性,所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。⑥固定化酶成本要低,以利于工業(yè)使用。三、固定化方法酶的固定化方法很多,但對(duì)任何酶都適用的方法是沒(méi)有的,必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)研究才能確定。(一)非共價(jià)結(jié)合法1.?結(jié)

4、晶法使酶結(jié)晶從而實(shí)現(xiàn)固定化的方法。2.??分散法通過(guò)酶分散于水不溶相中從而實(shí)現(xiàn)固定化的方法。3.吸附法（1）物理吸附法利用氫鍵、疏水鍵等作用力將酶固定于不溶性載體上。無(wú)機(jī)吸附劑：高嶺土、皂土、硅酸、氧化鋁等吸附量小、有些酶發(fā)生吸附變性有機(jī)吸附劑：大孔樹(shù)脂、葡聚糖凝膠、纖維素衍生物、膠原等吸附量略大(～50mg/g載體),不產(chǎn)生變性失活。比較受重視。（2）離子結(jié)合法酶通過(guò)離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體的固定化方法。CM-纖維素、DEAE-纖維素吸附量50--150mg/g優(yōu)點(diǎn)：操作方便,條件溫和,可再生后反復(fù)使用缺點(diǎn)：結(jié)合力較弱,不適宜的pH,高

5、鹽濃度,高底物濃度,高溫等往往能把吸附的酶解析下來(lái)。吸附法可以改善方法：1.選擇最佳條件操作（如溫度、pH）2.選吸附量大的載體，控制酶和載體量，3.采用高酶量吸附4.開(kāi)發(fā)新載體5.對(duì)酶進(jìn)行修飾后再進(jìn)行交換吸附(二)化學(xué)結(jié)合法1、共價(jià)結(jié)合法酶與載體以共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法。分為兩類：（1）將載體有關(guān)基團(tuán)活化，然后與酶有關(guān)基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。（2）在載體上接一個(gè)雙功能試劑，然后將酶偶聯(lián)上去。共價(jià)結(jié)合法偶聯(lián)成功與否取決于：載體：功能基團(tuán)，如羥基、芳香氨基，羧基，羧甲基等酶分子:側(cè)鏈非必需基團(tuán)（游離的α--氨基，lys—ζ—NH2,Arg--胍基C-COOH,A

6、sp—γ--羧基，Glu---羧基，酚羧基，巰基，咪唑基)但是，載體、酶分子上的基團(tuán)不會(huì)直接反應(yīng)，其功能基團(tuán)要活化。1)重氮化芳香氨基載體方法特點(diǎn)：載體先用亞硝酸處理成重氮鹽衍生物，再在溫和條件下和酶分子上相應(yīng)基團(tuán)直接偶聯(lián)。如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶的固定化，偶聯(lián)到重氮化的苯胺-多孔玻璃時(shí)，得到固化酶具很高酶活性2）溴化氰-亞氨碳酸基反應(yīng)帶羥基的載體在堿性條件下，載體的羥基和溴化氰反應(yīng)，生成活潑的亞氨碳酸酯衍生物，在弱堿中直接和酶的氨基進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)。最后一種是主要產(chǎn)物。此方法固定化后相對(duì)酶活力比較高，且相當(dāng)穩(wěn)定，同時(shí)操作也簡(jiǎn)便。是最受歡迎的一種方法2.交聯(lián)

7、法利用雙功能或者多功能試劑在酶分子之間或者載體之間；酶分子與載體之間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)而固定化。雙功能試劑：常用的是戊二醛OOH—C—CH2—CH2—CH2—C—H第一篇報(bào)道是：戊二醛交聯(lián)羧肽酶得到一種分子間交聯(lián)的固定化酶戊二醛有兩個(gè)醛基，均可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng),使酶蛋白交聯(lián)。此法與共價(jià)結(jié)合法利用的均是共價(jià)鍵，不同之處：交聯(lián)法不使用載體。（三）包埋法（entrapment）將酶用物理的方法包埋在各種載體（高聚物）內(nèi)。分為：網(wǎng)格型：將酶包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中。微囊型：將酶包埋在高分子半透膜中。將聚合物單體和酶溶液混合后，再用聚合促進(jìn)劑(包括交聯(lián)劑)的

8、作用而聚合，酶就包埋在載體中達(dá)到固定化。酶本身不參與反應(yīng)，所以較安全。但在聚合過(guò)