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《PCR在臨床檢驗中的應(yīng)用》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、PCR在臨床檢驗中的應(yīng)用醫(yī)學(xué)檢驗大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)兒大類，其分別代表兒代實驗診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子牛物學(xué)在疾病診斷中得到了長足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合嗨鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點。另外PCR反應(yīng)體系屮
2、各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管屮，既減少操作者的工作強度而.也減少了污染的機會，具有極高的使川價值。木公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創(chuàng)性意義。這些改進都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特并性、高敏感性、簡便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄牛蟲病、優(yōu)牛優(yōu)育、法醫(yī)學(xué)等廣泛領(lǐng)域中有相當(dāng)高的實際應(yīng)用價值。常見的傳染性疾病有細菌、病毒、衣原體、支原體等,可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應(yīng)的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國具有代表性意義的冇肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包搖乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝）,其
3、它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這兒種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病得。我國是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50%。乙肝病得經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細胞中增殖，也可以長期存聃在忖髓細胞或外周血白細胞中。通常用PCR法檢測血清中的乙肝病毒。冇報道川PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能。PCR法檢測乙肝的優(yōu)勢表現(xiàn)在：①早期診斷，因為PCR擴增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。②對
4、低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標(biāo)試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。③療效跟蹤及病程判斷，因為PCR能半定量檢測乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)暈多少的最直接指標(biāo)。在治療過程屮通過監(jiān)測血清或白細胞中病毒基因存在與否及其動態(tài)變化即能準(zhǔn)確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。H前用于丙肝病毒檢驗的方法主要是ELISA法測定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化,所以川丁?包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗丿泉與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽性或假陰性。同吋血清中抗體的出
5、現(xiàn)及動態(tài)變化與病人病情無線性相關(guān)關(guān)系。RT-PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（RT）后再進行PCR擴增，這種技術(shù)稱Z為逆轉(zhuǎn)錄一PCR（RT-PCR）。PCR敏感性高可以檢測出血清屮低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動態(tài)狀況。RNA純化要求嚴(yán)格，是RT-PCR的技術(shù)關(guān)鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對樣本中的RNA進行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA->cDNA逆轉(zhuǎn)錄的酶人致可以分為二大類，即低逆轉(zhuǎn)錄酶，如AMV/MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，高逆轉(zhuǎn)錄酶,如Tth酶。Tth酶在猛離子作用下,具有逆轉(zhuǎn)錄酶
6、活性,Tth酶活性度高,可以使核酸充分線性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實現(xiàn)單-管單酶單人份的擴增要求，這樣就在不降低擴增敏感性的條件下，一步完成擴增，不僅簡化操作，而且乂減少污染，提高檢測的準(zhǔn)確性。國內(nèi)木公司已采川這種技術(shù)推出氓管旳酶單人份的RT-PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病即協(xié)同感染。屮型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在丁急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長期存在于血清中。在PCR檢測時，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌(HP)所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP
7、可以經(jīng)口—口途經(jīng)傳播并定位丁?胃粘膜上皮細胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為冃潰瘍。我國胃炎發(fā)病率之高估計比乙型肝炎更嚴(yán)重，對HP的檢測應(yīng)受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的重視。対HP的檢測可以用生化法測試尿素酶或用免疫法測試血淸中対HP特異性抗體，也町對胃液、胃粘膜樣木進行細菌培養(yǎng)及菌種鑒沱。PCR法檢測HP非常墩感口特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢HiHPCPCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦,是目前最理想的方法。呼吸系統(tǒng)感染性疾病主要的
