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《原核表達(dá)及抗體制備》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、豬精子黏附蛋白AWN、PSP、MCP的原核表達(dá)及抗體制備實(shí)驗(yàn)材料15日齡杜洛克豬睪丸組織。實(shí)驗(yàn)菌株及載體大腸桿菌E.coliDH5a克隆菌株大腸桿菌E.coliBL21表達(dá)菌株pET-28a質(zhì)粒圖譜如下：OraIM(5W)Bpu11021(80)Xbol(1M)N0<1(166)Eagkite)Hind111(173)Salkm)Sacl(iw)EcoR1(192)BamHNhe1(231)Nd?l(2M)NCOl(2M)XbaIp3&)CiaM117)Nrul(40?)SmakPvu1(4426)Sgfk442S)Eco571(3772)A/wNBsaS1(3397)BspLU
2、IIUS血“、Sap008)廠、Bst1107l(2??)/Tth1111(2969)BstE11(1304)Aoal(l334>Mlul(1123)Bd1(1137)ECORV(1573)Hpa1(1629)Sphkfi6B>PE陵)PshAI(i9?>卜Bgl1(2187)、Fsp1(2205)P?p5110230)主要試劑主要試劑DNA提取試劑盒質(zhì)粒小提試劑盒膠冋收純化試劑盒OneStepCloning試劑盒TransStartFastPfuDNAPolymeraseEcoRI和HindHI限制性內(nèi)切酸酶EB核酸染料DNAmarker（DM2000）5xTAEIPTG卡那霍素（Am
3、p）中分子量預(yù)染蛋白Marker乙醇（分析純）醋酸（分析純）考馬斯亮藍(lán)G-250丙烯酰胺（Bis?Acr）過硫酸鍍（AP）SDS來源生工公司Omega公司Omega公司Vazyme公司北京全式金公司NEB公司BioTeke公司東盛公司本實(shí)驗(yàn)室保存Merck公司Tiangen公司鼎國昌盛公司楊凌三立化玻楊凌三立化玻Amresco公司Amresco公司Amresco公司本實(shí)驗(yàn)室保存滅菌水本實(shí)驗(yàn)室自制一、基因的克隆1?提取睪丸組織DNA(DNA抽提試劑盒)(1)取約20嗎杜洛克豬睪丸組織，用液氮研磨成粉末狀，加到1.5ml離心管中，再加入180卩1BufferACL、20u1Proteinas
4、eK溶液，震蕩混勻。在56°C水浴lh；(2)加入200ulBufferCL,并進(jìn)行充分顛倒混勻;加入200U1的無水乙醇，并進(jìn)行充分顛倒混勻；(3)將試劑盒中的吸附柱放入收集管中，用移液器將進(jìn)行消化了的產(chǎn)物全部加入吸附柱中，靜置3min,再用lOOOOrpm室溫離心lmin,倒掉收集管中的廢液；(4)將吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加500P1CW1Solution,室溫,lOOOOrpm離心30S,倒掉收集管中廢液；(5)將吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加500P1CW2Solution,lOOOOrpm離心30S,倒掉收集管中廢液；(6)將吸附柱放回收集管中，在12000rpm,室
5、溫離心2min,將殘留的CW2Solution離去；(7)取岀吸附柱，放入到一個新的1.5ml離心管中，加入60U1CEBuffer靜置4min,12000rpm,室溫離心2min,收集DNA溶液。最后將提取的DNA放入-20°C保存。2.PCR擴(kuò)增Awn部分外顯子基因根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫得知，豬的Awn基因全長465bp,共有5個外顯子，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計三對overlap擴(kuò)增引物。其中，Awn-F,Awn-R擴(kuò)增的是第2外顯子部分序列和第3號外顯子，設(shè)計產(chǎn)物大小189bp；Awn-1和Awn-2擴(kuò)增第4號外顯子，設(shè)計產(chǎn)物大小229bp；Awn-3和Awn?4擴(kuò)增第5號外顯子，設(shè)計產(chǎn)
6、物大小109bp。表1.引物序列名稱引物序列大小Awn-FATGGGTCGCGGATCCGAATTCGCATGGAACAGAAGGTCTCGTTCCTGTGGCG52bpAwn-RCTCCTTCCCGCAGCTGAGGTTGAGAGGCGGTATTGCCAG39bpAwn-1CTGGCAATACCGCCTCTCAACCTCAGCTGCGGGAAGGAG39bpAwn-2AGTAAGGAAAAGGTAAGGGGCCTTCTGGATCAGCATAGTAATAT44bpAwn-3ATATTACTATGCTGATCCAGAAGGCCCCTTACCTTTTCCTTACT44bpAwn-4CTCGA
7、GTGCGGCCGCAAGCTTAGGGATGTTTTTCTCTGTAG41bpPCR反應(yīng)體系如下（50卩1反應(yīng)體系）組分添加量5xPCRstimulant10ul5xTransStartFastPfuBuffer10P1dNTPs5p1上游引物Awn-F/Awn-1/Awn-31Ml下游引物Awn-R/Awn-2/Awn-41U1豬睪丸DNA1Pl滅菌水21MlTransStartFastPfuDNAPolymerase1ulPC
