乙型肝炎病毒(HBV)實(shí)時(shí)熒光定量PCR

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1、乙型肝炎病毒（HBV）實(shí)時(shí)熒光定量PCR?[目的要求]掌握??血清中HBV-DNA的提取方法及原理；HBV-DNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR的測(cè)定原理；HBV-DNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果分析?了解??核酸測(cè)定引物設(shè)計(jì)原理；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的工作原理及操作。[教學(xué)時(shí)數(shù)]講授2學(xué)時(shí)，實(shí)驗(yàn)6學(xué)時(shí)。[講授內(nèi)容]血清中病毒DNA的提取方法和原理；實(shí)時(shí)熒光定量PCR的測(cè)定原理；核酸測(cè)定引物設(shè)計(jì)原理；HBV-DNA測(cè)定引物設(shè)計(jì)思路；HBV-DNA熒光定量PCR試劑組成、相應(yīng)作用及反應(yīng)混合液配制；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的工作原理及操作[實(shí)驗(yàn)內(nèi)容]分組提取血清中HBV-DNA；配制反應(yīng)液并上機(jī)操作，實(shí)時(shí)觀

2、察，結(jié)果分析；實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論；實(shí)驗(yàn)總結(jié)[自學(xué)內(nèi)容]“感染性疾病的分子診斷”???實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（自編）???實(shí)驗(yàn)??乙型肝炎病毒（HBV）實(shí)時(shí)熒光定量PCR【原理】RealtimePCR是普通PCR的一項(xiàng)改進(jìn)，使用了針對(duì)擴(kuò)增DNA的熒光物質(zhì)，使得DNA的數(shù)量與檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系，大致得到DNA的擴(kuò)增曲線，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。即對(duì)DNA靶分子的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量的核酸檢測(cè)。該方法精確、靈敏、特異性強(qiáng)、污染途徑小、自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)單。是國(guó)際公認(rèn)的核酸分子定量的標(biāo)準(zhǔn)方法。它已逐漸代替了Northernblotting以及semiRT-PCR技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)從HBV攜帶者或者

3、乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因組DNA，采用核酸擴(kuò)增結(jié)合TaqMan熒光探針技術(shù),利用一對(duì)乙肝病毒特異性引物和一特異性結(jié)合于擴(kuò)增區(qū)另一位點(diǎn)的TaqMan探針,實(shí)現(xiàn)對(duì)乙肝病毒模板的擴(kuò)增和檢測(cè)。使用商品化試劑盒：HBV實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒，深圳匹基公司（PG，Biotech.）。針對(duì)表面抗原S基因，設(shè)計(jì)一對(duì)引物和一個(gè)探針。TaqMan熒光探針技術(shù)中，兩個(gè)熒光染料標(biāo)記在探針上，一個(gè)叫報(bào)告基團(tuán)（R），一個(gè)叫淬滅基團(tuán)（Q）。當(dāng)兩個(gè)熒光基團(tuán)都連在探針上時(shí)，報(bào)告基團(tuán)的熒光被淬滅基團(tuán)抑制。在延伸中，DNA聚合酶利用5’→3’外切酶活性把報(bào)告基團(tuán)從探針上切下來。一旦和淬滅基團(tuán)分開，報(bào)告基團(tuán)釋放出熒光。通過監(jiān)測(cè)熒

4、光信號(hào)的積累來反映乙肝病毒DNA的擴(kuò)增.產(chǎn)物的積累，根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征使用外部標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)初始模板定量（圖4）。????????????????圖4：TaqMan熒光探針技術(shù)原理??????????????R:熒光報(bào)告基團(tuán)??Q：熒光淬滅基團(tuán)【試劑與器材】1．HBV-DNA檢測(cè)試劑盒：DNA提取液1，DNA提取液2，PCR預(yù)混合液（含有Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液、dATP、dUTP、dGTP、dCTP引物、熒光標(biāo)記的探針）、Taq酶、UNG，強(qiáng)陽性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、臨界陽性血清，四種不同濃度的陽性參控品、雙蒸去離子水。2．熒光定量PCR儀3．PCR反應(yīng)管4．移液器及移液器吸頭5．高速

5、離心機(jī)6．漩渦混合器7．超凈工作臺(tái)8．調(diào)溫電熱板【操作步驟】1.???試劑和主反應(yīng)混合物的準(zhǔn)備：從試劑盒中取出HBVPCR反應(yīng)液、Taq酶及UNG。室溫融化后，2000rpm離心10sec，設(shè)需要的管數(shù)為n（n=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管強(qiáng)陽性對(duì)照+1管室內(nèi)質(zhì)控+1管試劑空白+4管陽性參控品），40ul測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：試劑PCR反應(yīng)液Taq酶UNG用量37.6ul0.4ul0.06ul計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積試管中，充分混合均勻，向設(shè)定的n個(gè)PCR反映管中分別加入38ul，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。2.???樣本的制備和上樣（1）標(biāo)本處理取n個(gè)0.5ml滅菌離心管，做好標(biāo)記。首先加

6、入100ulDNA提取液1，再分別加入待測(cè)血清或血漿樣本（切勿吸入血細(xì)胞）以及各種對(duì)照品各100ul，振蕩混勻，13000rpm離心10min：吸棄上清（離心時(shí)注意固定離心管方向，盡可能吸棄上清且不碰沉淀）；再加入25ulDNA提取液2，振蕩10sec（沉淀無需打散、混勻），100℃干浴，13000rpm離心10min，保留上清備用。如果樣本裂解產(chǎn)物當(dāng)天不使用，則要保存在-20℃。（2）上樣若樣本及對(duì)照品裂解產(chǎn)物保存在-20℃，使用前置室溫解凍，以13000rpm離心5min。在所設(shè)定的n個(gè)反應(yīng)管中分別加入步驟1中處理過的樣本、陰性對(duì)照、強(qiáng)陽性對(duì)照和室內(nèi)質(zhì)控血清、滅菌去離子水以及陽性參控品各2

7、ul，蓋緊PCR反應(yīng)管管蓋，并記錄樣本信息。3.???PCR上機(jī)擴(kuò)增檢查反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器；檢查并消除反應(yīng)管底氣泡。按設(shè)置裝載反應(yīng)管，選擇或設(shè)置擴(kuò)增和檢測(cè)條件：選擇預(yù)設(shè)的程序文件或設(shè)置為：370C：3min；940C：1min；950C：5sec，600C：30sec，40個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)收集設(shè)在600C。設(shè)置模板：設(shè)置孔位及熒光（詳見相應(yīng)儀器的操作手冊(cè)）。保存數(shù)據(jù)文件并運(yùn)行