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1、多酚氧化酶特性研究摘要：采用分光光度法，對板栗仁多酚氧化晦（PPO）的催化特性、最適波長、最適反應時間、最適溫度、最適pH值、熱穩(wěn)定性等性質進行了研究，同時研究了Vc、EDTA、NaCl.檸檬酸4種添加劑對板栗仁多酚氧化酶活性的影響。結果表明：板栗仁多酚氧化酶催化氧化產物的最大吸收波長為410nm,最佳反應時間為3min,最適反應溫度為30°C,最適pH值為6.0,米氏常數(shù)Km=0.0694mo1/L,Vmax=3.9180I）/mino95°C水浴處理5min該酶己基本失活，其屮Vc和EDTA對板栗仁多酚氧化酶酶促褐變有很好的抑制效果。關鍵詞：板栗；多酚氧化
2、酶；褐變;抑制多酚氧化酶（Polyphenoloxidase,PPO）是由核基因編碼的銅金屬酶，其酶促褐變機制是：內源性酚類物質在多酚氧化酶的催化下氧化生成幅，幅再相互作用生成高分子聚合物，從而導致褐色素的生成。它能催化兩類不同的反應，可以使一元酚輕基化，生成相應的鄰二魁基化合物;也可以氧化鄰苯二酚生成幅［l］o而酚類物質是果疏紐.織褐變的物質基礎，不同植物、同一植物的不同組織，同一植物的不同品種、生長環(huán)境以及不同的發(fā)育期，其褐變的主要酚類物質均有所不同，導致酶褐變活性也有所差異。云南富產板栗，但對板栗仁PPO的活性及影響活性因索的研究則未見報道。1材料與方法
3、1.1材料板栗市場購外觀良好，無病蟲害，無機械損傷新鮮的云南板栗。1.2試劑與儀器主要試劑：聚乙烯毗咯烷酮（PVPP）、鄰苯二酚、乙酸鈉、冰乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甲醇、乙醛、鹽酸、維生素C（Vc）、EDTA.檸檬酸、氯化鈉等，均為國產分析純。主要試驗儀器：TGL-16G高速臺式冷凍離心機、722W型分光光度計、HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋、冰箱等。1.3試驗方法1.3.1粗酶液的制備酶液提取參照文獻［2］的方法，有所改進。稱150g冷凍鮮樣，加入PH值6.0的0.05mol/L冷凍磷酸緩沖液150mL和15gPVPP,打漿，過濾，于3°C下12000r/m
4、in離心15min,取上清液置于0~4°C保存?zhèn)溆谩?.3.2褐變度（BD）的檢測稱5g樣品加入15mL蒸憾水中研磨，離心（14000r/min>15min）0沉淀溶于15mL甲醇甲酸溶液（休積比1:1）,充分浸提15min后離心。將兩次所得上清液混勻后用蒸水定容為25mL,離心，取上清液檢測410nm下的吸光值AnX10表示。1.3.3總酚（TP）的提取和含量檢測稱取5g樣品，加入15n）L乙醛-鹽酸溶液（pII3.0）研磨，在恒溫水浴中震蕩lh,取出離心15000r/min,30min,量取濾液體積，吸取5mL,用蒸水定容到50mL,測定A值，用鄰苯二酚做
5、標準曲線。1.3.4酶活性的測定取2n±0.2mol/L鄰苯二酚溶液和2mL—定pH值的磷酸緩沖溶液加入到試管屮，然后加入0?5］譏的粗酶液，水浴保溫3min后立即倒人比色管屮，在410nni波長處測定反應混合液的吸光值變化（AA）,每30s讀數(shù)1次，共記錄3mino空白用蒸館水代替鄰苯二酚。酶活性以IminAA值為每增加0.001為1個活力單位(U)o檢測410nm下的吸光值表示為A=UX100o1結果與分析1.1工作波長的選擇體系反應產物在可見光波350~470nm下的吸光度見圖1所示。毘1.4次1.2渓10.80.60.40.23503703904104
6、30450470—?—A:3min—■B:6minC:9minD:12min—米—E:15min波長PP0酶促反應體系每隔3min的波長掃描圖。由圖1可以看出在從350nm后吸光值一直呈下降的趨勢，但當反應液在410nm處時吸光度值便出現(xiàn)上升，并從最初3niin的約0.527升到9min的約0.63&隨著時間的延長反應液在410nm處的吸光度值逐漸增人。當反應15min后吸光度值已經增大到接近0.87,并形成一個大的波峰，說明該晦促反應的產物最大吸收波K在410nm處，故以此波長處的吸光度來衡量PPO酶促反應速度的人小。2.2PPO的活性測定以1.3.4中所述
7、的方法進行PPO活性的測定，其結果見圖2所示：在5min內，隨著時間的延長吸光值也隨之增人，在反應達3min時吸光度的變化達到最人，此后增長趨于平穩(wěn)。因此試驗的測定均采用反應3min時410mn處的0D值表示PPO的活力。時間(S)圖2ppo反應進程曲線2.3總酚含量與褐變度的關系按照1.3.3中總酚測定方法測定，以鄰苯二酚濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標，總酚標準工作曲線見圖3。0.30.250.20.150」0.05000.00.00.00.00.10.1總酚含量工作標準曲線由于吸光值越大說明褐變越厲害,出圖3可以看出，總酚含量與褐變度的關系為直接相關，而相關
8、系數(shù)很大(R2=0.9692),說明總
