微生物數(shù)量測(cè)定

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1、《環(huán)境微生物新技術(shù)》課程作業(yè)2.微生物數(shù)量測(cè)定方法有哪些？空氣、水、土壤樣品分別適用哪些方法？請(qǐng)舉例說(shuō)明。常見(jiàn)微生物數(shù)量的測(cè)定方法<1>1.計(jì)數(shù)器測(cè)定法：即用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。取一定體積的樣品細(xì)胞懸液置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的計(jì)數(shù)室內(nèi)，用顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的(O.1mm3)，因而根據(jù)計(jì)數(shù)器刻度內(nèi)的細(xì)菌數(shù)，可計(jì)算樣品中的含菌數(shù)。本法簡(jiǎn)便易行，可立即得出結(jié)果。?本法不僅適于細(xì)菌計(jì)數(shù)，也適用于酵母菌及霉菌孢子計(jì)數(shù)。2、電子計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法:電子計(jì)數(shù)器的工作原理是測(cè)定小孔中液體的電阻變化，小孔僅能通過(guò)一個(gè)細(xì)胞，當(dāng)一個(gè)細(xì)胞

2、通過(guò)這個(gè)小孔時(shí)，電阻明顯增加，形成一個(gè)脈沖，自動(dòng)記錄在電子記錄裝置上。?該法測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確，但它只識(shí)別顆粒大小，而不能區(qū)分是否為細(xì)菌。因此，要求菌懸液中不含任何碎片。3、活細(xì)胞計(jì)數(shù)法?:常用的有平板菌落計(jì)數(shù)法，是根據(jù)每個(gè)活的細(xì)菌能長(zhǎng)出一個(gè)菌落的原理設(shè)計(jì)的。取一定容量的菌懸液，作一系列的倍比稀釋?zhuān)缓髮⒍康南♂屢哼M(jìn)行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，可算出活菌數(shù)。?此法靈敏度高，是一種檢測(cè)污染活菌數(shù)的方法，也是目前國(guó)際上許多國(guó)家所采用的方法。使用該法應(yīng)注意：①一般選取菌落數(shù)在30～300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，過(guò)多或過(guò)少均不準(zhǔn)確；②

3、為了防止菌落蔓延，影響計(jì)數(shù)，可在培養(yǎng)基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。廣泛應(yīng)用于水、牛奶、食物、藥品等各種材料的細(xì)菌檢驗(yàn)，是最常用的活菌計(jì)數(shù)法。4、比濁法?比濁法是根據(jù)菌懸液的透光量間接地測(cè)定細(xì)菌的數(shù)量。細(xì)菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成反比，與光密度成正比，所以，可用光電比色計(jì)測(cè)定菌液，用光密度(OD值)表示樣品菌液濃度。?此法簡(jiǎn)便快捷，但只能檢測(cè)含有大量細(xì)菌的懸浮液，得出相對(duì)的細(xì)菌數(shù)目，對(duì)顏色太深的樣品，不能用此法測(cè)定。5、測(cè)定細(xì)胞重量法?此法分為濕重法和干重法

4、。濕重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后將濕菌體進(jìn)行稱(chēng)重；干重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后，以清水洗凈放人干燥器加熱烘干，使之失去水分然后稱(chēng)重。??????此法適于菌體濃度較高的樣品，是測(cè)定絲狀真菌生長(zhǎng)量的一種常用方法。6、測(cè)定細(xì)胞總氮量或總碳量?氮、碳是細(xì)胞的主要成分，含量較穩(wěn)定，測(cè)定氮、碳的含量可以推知細(xì)胞的質(zhì)量。此法適于細(xì)胞濃度較高的樣品。7、顏色改變單位法（colour?change?unit,簡(jiǎn)稱(chēng)CCU）????通常用于很小，用一般的比濁法無(wú)法計(jì)數(shù)的微生物，比如支原體等，因?yàn)橹гw的液體培養(yǎng)物是完全透明的，呈現(xiàn)為清亮透明紅色

5、，因此無(wú)法用比濁法來(lái)計(jì)數(shù)，由于支原體固體培養(yǎng)很困難，用cfu法也不容易計(jì)數(shù)，因此需要用特殊的計(jì)數(shù)方法，即CCU法。它是以微生物在培養(yǎng)基中的代謝活力為指標(biāo)，來(lái)計(jì)數(shù)微生物的相對(duì)含量的，下面以解脲脲原體為例單介紹其操作：（1）取12只無(wú)菌試管，每一管裝1.8ml解脲脲原體培養(yǎng)基。?（2）在第一管加入0.2ml待測(cè)解脲脲原體菌液，充分混勻，從中吸取0.2ml加入第二管，依次類(lèi)推，10倍梯度稀釋?zhuān)恢钡阶钅┮还?（3）于37度培養(yǎng)，以培養(yǎng)基顏色改變的最末一管作為待測(cè)菌液的CCU，也就是支原體的最大代謝活力，比如第六管出現(xiàn)顏色改變，他的

6、相對(duì)濃度就是10的6次方CCU/ml.?取一定體積的樣品細(xì)胞懸液置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的計(jì)數(shù)室內(nèi)，用顯微鏡觀察計(jì)數(shù)或做片在顯微鏡下數(shù)，均稱(chēng)為顯微鏡直接計(jì)數(shù)法。?用瓊脂平板計(jì)數(shù)，稱(chēng)為菌落計(jì)數(shù)法?。?一般來(lái)說(shuō)，比濁法和菌落計(jì)數(shù)法就可以滿(mǎn)足絕大多數(shù)細(xì)菌的計(jì)數(shù)，但是對(duì)支原體這樣比較特殊的微生物，用CCU法比較合適。?<2>微生物主要包括原核微生物、真核微生物、病毒等三大類(lèi)，由于多數(shù)微生物的個(gè)體較小，肉眼無(wú)法觀察，對(duì)其計(jì)數(shù)一般比較困難。在目前的微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué),對(duì)微生物計(jì)數(shù)的方法主要有三大類(lèi)：總細(xì)胞計(jì)數(shù)法、活細(xì)胞計(jì)數(shù)法和微生物生長(zhǎng)量測(cè)定法。并

7、不是每一種方法都是通用的,不同的微生物種類(lèi)需要不同的計(jì)數(shù)方法,目前多用以下8種方法進(jìn)行計(jì)數(shù)：1.總細(xì)胞計(jì)數(shù)法1.1血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法血細(xì)胞計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片,其上劃有計(jì)數(shù)室,通過(guò)對(duì)計(jì)數(shù)室中的微生物數(shù)量的讀取,計(jì)算原溶液中的微生物數(shù)量。此方法由于計(jì)數(shù)板較厚,且計(jì)數(shù)室的高度是0.1mm,不能采用油鏡進(jìn)行觀察,故只能對(duì)體積較大的真核微生物進(jìn)行測(cè)定,如酵母菌、霉菌抱子等,只能測(cè)得所有細(xì)胞的總數(shù),不能區(qū)別死細(xì)胞和活細(xì)胞,尤其是對(duì)運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)的活細(xì)胞難以計(jì)數(shù)。目前已經(jīng)提出一些方法,如結(jié)合特定的美藍(lán)染色技術(shù),區(qū)別酵母菌死活細(xì)胞,將運(yùn)動(dòng)

8、的細(xì)胞加人甲醛溶液中,破壞其運(yùn)動(dòng)以便計(jì)數(shù)等。1.2細(xì)菌計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法細(xì)菌計(jì)數(shù)板是在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的基礎(chǔ)上改進(jìn)而來(lái),主要是降低計(jì)數(shù)板的厚度,同時(shí)將計(jì)數(shù)室的高度從0.1mm降低到0.02mm,以用油鏡對(duì)較小的原核微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)。1.3膜過(guò)濾計(jì)數(shù)法利用計(jì)數(shù)板對(duì)高濃度的菌液測(cè)定比較準(zhǔn)確,但當(dāng)樣品中細(xì)菌