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1、免疫血清的制備與鑒定(PreparationandIdentificationofAntiserum)%1.原理免疫血淸或稱抗血淸,為含有某種抗原特異性的抗體分子的動物血淸,一般是從通過人工注射某種抗原的免疫動物制備的。優(yōu)質的高效價抗血清可用于教學、科研以及疾病的診斷和治療。某種物質進入體內后能否引起被免疫的動物產生抗體生成反應,一方面取決于抗原分子表面有無特杲性的抗原決定簇(AntigenicDeterminant)或稱表位(Epilope);另一方而取決于被免疫動物的機體的免疫狀態(tài)。當具備上述嗎個條件時,如果抗原劑量合適,免疫接種的途
2、徑恰當,被免疫的動物就將遵循抗體生成的一般規(guī)律——初次反應和再次反應,產生抗體并獲得免疫血清。制備免疫血清除需要純化抗原外、還需要選擇合適的動物及恰當的注射途徑,優(yōu)質的高效價免疫血清還與注射的抗原劑量,接種的次數等有著密切的關系。%1.抗原為了制備特異性強,效價高,親和力好的優(yōu)質免疫血清。首先必須要有合適的抗原。免疫血清的特異性除了與抗原的分子量大小有關外,還與抗原分子表面抗原決定簇的性質、空間位置、立體構象以及種屬差異等密切相關??乖姆N類繁多,依其來源的不同可以分為天然抗原、人工抗原、合成抗原,重組抗原等。天然抗原乂可分為可溶性抗原(
3、如血清、毒索,組織浸出液,組織或細胞蛋白質等)、顆粒性抗原(如細菌、病毒、細胞等)、半抗原(本身無免疫原性,必須與載體蛋白結合后才有免疫原性,如青霉素、氯鑫素、雌激素、胰島素等)、合成性抗原(如多肽等)以及基因工程抗原等。%1.動物的選擇家兔、羊、馬、驢、大鼠、小鼠、豚鼠、雞、猴等都是常用的免疫動物,在實驗中,選擇動物時應考慮抗原與動物的種屬關系、抗原性質與動物種類、免疫血清需要雖、免疫血清要求以及動物個體和用途等因素。實驗用免疫血清多選用家兔、大鼠、小鼠、豚鼠和雞,商業(yè)用牛產多用馬、羊、驢,特殊情況選用猴。此外,免疫用動物述應選適齡、健
4、壯.最好為雄性。實驗用免疫血清最常用的動物是家兔,一般選擇選擇當年繁殖的,體重2?3公斤,年齡在6個月以上的雄性,健康家兔,免疫前用金屬編號牌固定兔耳,或用染料涂沐在動物的背部,做出明飾的標記。免疫前,還應采血測定動物體內有無低滴度交叉反應性天然抗體的存在。%1.免疫途徑,免疫劑量和免疫周期不同的免疫途徑,抗原在體內的的代謝速度不同,對免疫系統(tǒng)的刺激強弱也就不同,因而,產生抗體的水平也就不同。抗原的注射途徑可根據免疫動物個體的人小、抗原及抗體制備目的或要求的不同,選用皮內、皮下、肌肉、靜脈、淋巴結內或腹腔等不同途徑注入抗原進行免疫。一般家
5、兔常采用背部、足掌、淋巴結周圍、耳后籌處皮內或皮下多點注射,皮內和肌肉途徑較少采用。免疫原的注射劑量隨抗原的性質有較人差異。一般應考慮抗原的免疫原性的強弱、分子量人小、抗原的純度、毒性的有無以及動物個體的狀態(tài)、免疫途徑和免疫時間,佐劑的使用與否等。對于純的町溶性抗原,免疫時一?般需要與等量的弗氏完全佐劑(Freund'sCompleteAdjuvant)混合,其免疫劑量通常小甌首次抗原劑量為50?100吒/次,大僦為100?200ug/次,兔為100ug?1000ug/次,合成免疫原為2mg(半抗原約為20?200ug)。加強免疫的劑量為
6、首次計量的1/2,可用不完全弗氏佐劑或不用佐劑。如需制備髙度特界性的抗血清,可選用低劑量抗原短程免疫法;反之,欲獲得高效價的抗血淸,宜采用大劑量抗原長程免疫法。免疫周期一般隨抗原和免疫方法的不同以及是否使用佐劑血變化。間隔時間可從數日到數周,一般無佐劑時間隔2-4天,加用佐劑時可間隔10-30天。初次免疫與第二次免疫的間隔時間多為2?4周,此后,每次加強免疫的間隔時間為2-3周。%1.佐劑佐劑乂稱免疫增強劑。它可以增強抗原的免疫原性以及改變機體的免疫反應性,達到增強免疫力或提高抗體產牛水平以及使抗原在體內維持時間明顯延長等功效。佐劑的種類
7、很多,在免疫血淸的制備屮通常多用弗氏佐劑(Freund*sAdjuvant),也有學者譯為福氏佐劑。弗氏佐劑分為屮;氏完全佐劑和JI:氏不完全佐劑(Freund'sIncompleteAdjuvant)o二者主要的差別在丁訕;氏完全佐劑禽有卡介苗。%1.免疫原的制備1.抗原稀釋:免疫用的抗原一般應使用新配制的滅菌牛理鹽水或PBS稀釋,然后再與佐劑等量混合制成乳劑后用于動物免疫。2.抗原的乳化:乳化的方法有乳缽研磨法、注射器推注法,超聲乳化法和機械攪拌法等多種。1)注射器推注法:是將抗原溶液和等量的完全佐劑(注意佐劑必須預先加熱融化,但不超
8、過50°C)分別吸入兩個5ml注射器內,在兩個注射器的1才針頭間用一根長約數厘米的醫(yī)用無毒塑料管,將兩個注射器連接在一起(塑料管必須先經酒精浸泡消毒,使用時収出,用滅菌生理鹽水沖洗后,與注射器