丙型肝炎病毒核酸定量檢測標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)指導(dǎo)書

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1、丙型肝炎病毒核酸定量檢測標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)指導(dǎo)書1.目的采用PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光探針技術(shù)，用于臨床血清或血漿標(biāo)本中的丙型肝炎病毒核酸的定性檢測，適用于丙型肝炎病毒感染的輔助診斷。2.范圍適用于丙型肝炎病毒核酸定量檢測。3.職責(zé)3.1操作人員：負(fù)責(zé)標(biāo)本制備檢測、儀器操作、報(bào)告發(fā)送。3.2專業(yè)組組長：負(fù)責(zé)本組耗材的請購，監(jiān)督本組標(biāo)本檢測、儀器操作、報(bào)告發(fā)送、質(zhì)控管理等各方面工作。3.3實(shí)驗(yàn)室主任：負(fù)責(zé)監(jiān)督和指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室各方面工作。4.原理采用熒光PCR技術(shù)，以丙型肝炎病毒基因編碼區(qū)的高度保守區(qū)為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針，進(jìn)行一步法RT-

2、PCR擴(kuò)增，并檢測熒光信號，儀器軟件系統(tǒng)自動繪制出實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，根據(jù)閾循環(huán)值(CT)實(shí)現(xiàn)對未知樣本的檢測。另外，本試劑盒帶有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，用于對核酸提取的整個(gè)過程進(jìn)行監(jiān)控，減少假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。5.樣本要求5.1適用標(biāo)本類型：血清5.2標(biāo)本采集用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2ml,注入無菌的真空采血管屮(未加抗凝劑)，室溫(22-25°C)放置30-60min血標(biāo)本可自發(fā)完全凝集析出血清，或直接使用水平離心機(jī)，1500ipm離心5min；吸取上層血淸，轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管。5?3標(biāo)本保存和運(yùn)送所釆集的標(biāo)本可立即用于測試或長

3、期保存于?70°C,也可保存于?2(rc待測，保存期為3個(gè)月，標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融。標(biāo)本運(yùn)送采用干冰(或者冰袋)保持低溫，運(yùn)輸時(shí)間不應(yīng)超過4天。5.4拒收標(biāo)本：拒絕重度溶血樣本、肝素抗凝的血漿。6.儀器和試劑6.1設(shè)備AB7500核酸擴(kuò)增儀、恒溫金屬浴、生物安全柜、低溫離心機(jī)等。6.2試劑生產(chǎn)廠家：屮山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)批號：YZB/S7271-2013最低檢出量：最低檢出量為500IU/ml試劑各組分見表1：7.操作步驟表1試劑盒組分表組分名稱規(guī)格數(shù)量核酸提取試劑RNA提取液A200ul/管1RNA提取液B5ml/

4、瓶2DEPCH2O3ml/瓶1PCR檢測試劑HCV內(nèi)標(biāo)溶液100ul/管1HCV反應(yīng)液A270ul/管1HCV反應(yīng)液B30ul/管1質(zhì)控品陰性質(zhì)控品200ul/管1HCV強(qiáng)陽性質(zhì)控品200ul/管1HCV臨界陽性質(zhì)控品200ul/管17?1試劑準(zhǔn)備（試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)）7.1.1進(jìn)入試劑準(zhǔn)備區(qū)，打開通風(fēng)設(shè)備，按照消毒清潔程序擦拭實(shí)驗(yàn)臺面，并在檢驗(yàn)流程記錄表上做相應(yīng)記錄。7.1.2PCR反應(yīng)液配制7.1.2.1取出HCV反應(yīng)液A、HCV反應(yīng)液AB,室溫溶化后振蕩混勻，8000rpm離心數(shù)秒后使用。7.1.2.2収出N個(gè)（N=待測樣本

5、數(shù)+4個(gè)HCV陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品+HCV強(qiáng)陽性質(zhì)控品+HCV臨界陽性質(zhì)控品+陰性質(zhì)控品+空白孔）PCR反應(yīng)管，HCV單人份擴(kuò)增體系配制見表2：表2PCR反應(yīng)液配置表組分HCV反應(yīng)液AHCV反應(yīng)液B總體積用量/人份27ul3ul30ul將各組分充分混勻，混合好后進(jìn)行短時(shí)離心將管壁上的液體全部離心至管底，Z后將30U1擴(kuò)增體系分裝到PCR反應(yīng)管，反應(yīng)液分裝時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡，蓋緊管蓋，經(jīng)傳遞窗傳遞到標(biāo)本制備區(qū)。7.1.375%乙醇配制:取2.25ml的DEPCH20,加入6.75ml的無水乙醇,振蕩混勻，配制成75%乙醇，蓋緊蓋子，經(jīng)傳

6、遞窗傳遞到標(biāo)本制備區(qū)。7.2RNA提取（標(biāo)本制備區(qū)）7.2.1進(jìn)入標(biāo)本制備區(qū)，從傳遞窗中取出PCR反應(yīng)管和75%乙醇，放入標(biāo)本制備區(qū)冰箱冷藏。7.2.2從冰箱取出待測樣本、陰性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品、RNA提取液A、RNA提取液B和內(nèi)標(biāo)液，放入生物安全柜內(nèi)室溫溶解，備用。723打開金屬浴，調(diào)節(jié)溫度為65°C,使儀器自動升溫。7.2.4用躡子夾取n個(gè)1.5ml滅菌離心管放于安全柜內(nèi)離心管架上。（n=待測樣本數(shù)+3=待測樣本數(shù)+HCV強(qiáng)陽性質(zhì)控品+HCV臨界陽性質(zhì)控品+陰性質(zhì)控品）7.2.5向離心管中各加入10ul內(nèi)標(biāo)

7、溶液，再分別加入200ul樣本，800ulRNA提取液B,蓋緊管蓋，振蕩混勻15s以充分混勻，室溫放置5min（每隔lmin旋渦振蕩5s,使裂解更充分，處理結(jié)束后瞬時(shí)離心。）7.2.6加入200ul無水乙醇，蓋緊管蓋，漩渦振蕩混勻15s以充分混勻，瞬時(shí)離心，再加入20ulRNA提取液A,漩渦振蕩混勻5s,室溫靜置lmin。8000rpm離心lmin,小心吸棄上清。7.2.7再加入200ulRNA提取液B,蓋緊管蓋，充分混勻（用移液槍吹打），室溫下8000rpm離心lmin,小心吸棄上清。7.2.8加預(yù)冷的75%乙醇400ul充分

8、混勻，8000rpm離心lmin,小心吸棄上清。7.2.9加預(yù)冷的75%乙醇400ul充分混勻，8000rpm離心lmin,小心吸棄上清。7.2.10打開管蓋，放入金屬浴，65°C干燥5min,使液體揮發(fā)完全。7.2.11溫育5min后，用銀子從金屬浴中取出離心