人脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定

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1、人脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定摘要目的：探索從健康成人脂肪組織中分離、培養(yǎng)并鑒定脂肪干細(xì)胞。方法：用健康成人的脂肪組織，剔除可見(jiàn)纖維結(jié)締組織后剪碎，膠原酶法分離并體外培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞，并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)鑒定。結(jié)果：可以從健康成人脂肪組織中提取出脂肪干細(xì)胞，體外環(huán)境擴(kuò)增傳代，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面高度表達(dá)CD29,CD44,CD105等，具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性。結(jié)論：可以從人脂肪組織中分離、培養(yǎng)出脂肪干細(xì)胞。關(guān)鍵詞脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)鑒定體外實(shí)驗(yàn)doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2011.08.004組織工程的一個(gè)研究重點(diǎn)，是種

2、子細(xì)胞的來(lái)源。研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織含有一種被稱(chēng)為ADSCs的細(xì)胞，它具有一般干細(xì)胞的特性，與骨髓干細(xì)胞相比，它具有明顯優(yōu)勢(shì)，在來(lái)源、取材、擴(kuò)增能力方面，都是骨髓干細(xì)胞所無(wú)法比擬的，可作為種子細(xì)胞應(yīng)用于組織工程。材料與方法試劑與儀器：低糖DMEM培養(yǎng)液，I型膠原酶，胎牛血清，PBS緩沖液，0.25%胰蛋白酶，恒濕培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡,細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，流式細(xì)胞儀，低速水平離心機(jī)，超凈工作臺(tái)，CD29、CD44、CD105。脂肪組織來(lái)源：實(shí)驗(yàn)所用成人脂肪組織來(lái)自蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院抽脂術(shù)的健康女性，年齡25?45歲。脂肪干細(xì)胞的原代培養(yǎng)：無(wú)菌條件下提取

3、脂肪組織約15g,PBS液洗去紅細(xì)胞。眼科剪剔除脂肪組織中可見(jiàn)血管，剪碎至細(xì)小顆粒，0.1%I型膠原蛋白酶消化，1500r/分離心10分鐘，去除脂肪細(xì)胞及上清液，D-hanks液重懸沉淀，200目細(xì)胞篩過(guò)濾，1500r/分離心10分鐘，所得細(xì)胞提取物用含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸，以適當(dāng)密度接種于無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，在37°C.C02體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育，5天后首次換液，之后3天換液1次，待原代細(xì)胞達(dá)85%融合時(shí)消化傳代。脂肪干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到85%融合時(shí),以0.25%胰蛋白酶將貼壁細(xì)胞消化分離3?

4、5分鐘，1：2進(jìn)行傳代，接種于25ml培養(yǎng)瓶中，3天換液1次，當(dāng)貼壁細(xì)胞接近融合時(shí)再次傳代。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)相關(guān)抗原：流式細(xì)胞儀對(duì)第3代脂肪干細(xì)胞表面相對(duì)特異性抗原進(jìn)行檢測(cè)。0.25%胰蛋白酶消化待檢細(xì)胞，1500r/分離心10分鐘，在細(xì)胞沉淀中（細(xì)胞數(shù)量約1X106）分別加入FITC-CD44熒光抗體，PE-CD29熒光抗體，APC-CD105熒光抗體各20ul,4°C孵育30分鐘，再用PBS緩沖液清洗2遍，最后用10%福爾馬林固定細(xì)胞，上機(jī)測(cè)定抗原的陽(yáng)性率。脂肪干細(xì)胞的形態(tài)：將有脂肪干細(xì)胞貼壁的培養(yǎng)瓶口旋

5、緊，水平放置在倒置顯微鏡下觀察，在原代細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后可見(jiàn)少量較大的呈梭形的脂肪干細(xì)胞貼壁，4天首次換液，細(xì)胞清晰可見(jiàn)，呈多角形、紡錘形，集落樣生長(zhǎng)。9天后細(xì)胞生長(zhǎng)明顯增加，呈渦旋狀生長(zhǎng)。從原代培養(yǎng)到第14天時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞鋪滿瓶底80%左右。而傳代細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯快于原代細(xì)胞。傳代后細(xì)胞增殖明顯加快，于第3天開(kāi)始數(shù)量明顯增多，5?6天后細(xì)胞即已長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底，細(xì)胞排列更加整齊有序，雜質(zhì)細(xì)胞極少見(jiàn)。見(jiàn)圖1、2o脂肪干細(xì)胞的表型特征：流式細(xì)胞儀分析第3代的脂肪干細(xì)胞的細(xì)胞表型，CD29陽(yáng)性率為86%±2%,CD44陽(yáng)性率為93%±1%,CD105

6、陽(yáng)性率為78%±2%O見(jiàn)圖3。討論脂肪干細(xì)胞的鑒定，尚無(wú)直接的方法。一般通過(guò)培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的分化表型逆推得知。研究證實(shí)多種干細(xì)胞皆可表達(dá)CD44,用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞CD44陽(yáng)性表達(dá)，表明細(xì)胞源自干細(xì)胞［1］。免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，CD29、CD44、CD105、CD13是間充質(zhì)干細(xì)胞的特征性表面標(biāo)志。它們?cè)谥靖杉?xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)說(shuō)明脂肪干細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞表型［2］。圖3脂肪干細(xì)胞的表型特征陶凱等［3］通過(guò)不同血清濃度作用下生長(zhǎng)曲線繪制發(fā)現(xiàn)，在血清濃度為15%和20%時(shí)，在最短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞可進(jìn)入平臺(tái)期，達(dá)到細(xì)胞增殖高峰期，綜

7、合考慮性價(jià)因素，實(shí)際應(yīng)用中可將15%作為血清的最適宜濃度。通過(guò)兩代生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，第2代細(xì)胞較原代細(xì)胞更快進(jìn)入增殖高峰，即細(xì)胞在最初傳代后，生長(zhǎng)加快，與實(shí)際培養(yǎng)中所見(jiàn)的適度傳代促進(jìn)增殖相一致。筆者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也得到了相似的結(jié)論。需要強(qiáng)調(diào)的是，研究中采用的雖是公認(rèn)的分離培養(yǎng)流程，但實(shí)際操作中得到的仍是一種混合細(xì)胞，其中混雜有部分前體細(xì)胞，如何純化及怎樣示蹤和標(biāo)記脂肪干細(xì)胞，是該領(lǐng)域亟需解決的問(wèn)題。參考文獻(xiàn)1付柏林，郭力?脂肪干細(xì)胞在表皮組織工程中的研究進(jìn)展[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,32(1)：80-82.2王紅祥，李賓公，邵詩(shī)穎，等?

8、人脂肪組織分離培養(yǎng)基質(zhì)干細(xì)胞的方法及其表型鑒定[J].中國(guó)臨床康復(fù),2006,10(41)：16-18.3陶凱，劉曉燕，梁久龍，等?人脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]?中國(guó)美容整形外