人脂肪間充質(zhì)干細胞體外分離培養(yǎng)方法

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1、人脂肪間充質(zhì)干細胞體外分離培養(yǎng)方法間充質(zhì)干細胞屬于成體干細胞，廣泛存在于骨髓、脂肪和臍帶等組織，下面是小編搜集整理的一篇探究干細胞體外分離培養(yǎng)方法的論文范文，供大家閱讀查看?！　〈竺娣e皮膚缺損、重度燒傷的傳統(tǒng)修復(fù)方法-自體或異體皮膚移植，因存在免疫排斥和供區(qū)不足等缺陷而限制了廣泛臨床應(yīng)用。近年來，干細胞相關(guān)機制及應(yīng)用的研究為皮膚創(chuàng)傷的治療帶來了新突破。研究顯示，間充質(zhì)干細胞能維持皮膚穩(wěn)態(tài)和促進皮膚創(chuàng)面修復(fù)，其機制包括促進細胞分化、免疫調(diào)節(jié)和分泌生長因子來促進創(chuàng)面再上皮化和血管形成[1-2].人脂肪間充質(zhì)干細胞(humanadipose-deriv

2、edmesenchymalstemcells,hAD-SCs)是由Zuk等[3]首次從抽脂術(shù)脂肪中分離出的一類具有多向分化能力的細胞群，因其具有豐富、容易獲取和擴增快等優(yōu)點，是組織工程的理想種子細胞。本實驗旨在提供一種有效的hADSCs體外分離培養(yǎng)方法，為以后臨床細胞移植提供實驗基礎(chǔ)。　　1材料與方法　　1.1材料成人腹部大X膜脂肪組織7例取自江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科剖宮產(chǎn)手術(shù)患者，年齡17~33歲，平均為26歲，健康狀況良好，無系統(tǒng)性疾病。低/高糖DMEM、Ⅰ型膠原酶(Gibco公司),胎牛血清(Hyclone公司),鼠抗人單克隆抗體CD29-FI

3、TC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE及其相應(yīng)同型對照(eBio-sciences公司),地塞米松、抗壞血酸磷酸鹽、β-甘油磷酸鈉、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、胰島素(Sigma公司).　　1.2方法　　1.2.1hADSCs細胞分離培養(yǎng)產(chǎn)科無菌條件下取出腹部大X膜脂肪組織約10ml,PBS清洗，剪碎，0.1%Ⅰ型膠原酶37℃消化45min,10%胎牛血清終止消化，離心，沉淀重懸，200目細胞篩過濾，再離心。加入完全培

4、養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1雙抗的低糖DMEM)重懸，以5104/ml接種于6孔板，置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后首次換液，之后每周換液2次，待細胞生長至80%融合時，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化傳代。實驗時用第3~9代細胞?！　?.2.2細胞免疫表型檢測取消化消化貼壁的第3代hADSCs,1000r/min離心5min,用PBS重懸分裝于1.5ml的EP管中，每管100μl,細胞密度為105/ml,加入鼠抗人CD29、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD166E、HLA-DR等單克隆抗體及其同型對

5、照。4℃避光孵育30min,PBS洗2次，加PBS300μl重懸后流式細胞儀檢測細胞表面抗原?！　?.2.3細胞生長曲線和倍增時間取處于對數(shù)生長期的第3、6和9代細胞，消化貼壁細胞，將細胞按5103/孔接種于24孔板，分7組，每組3孔，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每24h用臺盼藍計數(shù)一次，每次計3孔，取其平均數(shù);連續(xù)計數(shù)7d,將所得數(shù)據(jù)以天數(shù)為橫坐標(biāo)，細胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線。hADSCs細胞倍增時間按Patter-son公式計算[4].　　1.2.4成脂和成骨分化鑒定將80%融合的第3代hADSCs分別改用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1雙抗

6、、0.5mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1μM地塞米松、10μM胰島素、200μM吲哚美辛的高糖DMEM)和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1雙抗、0.1μM地塞米松、50μM抗壞血酸磷酸鹽、10mMβ-甘油磷酸鈉的高糖DMEM),誘導(dǎo)14d后分別油紅染色鑒定脂滴和VonKossa染色鑒定鈣結(jié)節(jié)?！　?.3統(tǒng)計學(xué)分析以SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析。當(dāng)P<0.05時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義?！　?結(jié)果　　2.1hADSCs細胞分離培養(yǎng)接種48h后可見散在貼壁細胞，呈圓形或梭形，換液除去非貼

7、壁細胞;一般培養(yǎng)7~8d達到80%以上融合，細胞形態(tài)逐漸均一，排列趨于方向性，呈放射狀或河流狀;3~9代的細胞形態(tài)無明顯改變。　　2.2細胞免疫表型檢測通過流式檢測hADSCs多個細胞表面分子標(biāo)記物，結(jié)果顯示CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166表達均在95%以上，CD45和HLA-DR表達均在5%以下?！　?.3細胞生長曲線和倍增時間生長曲線顯示hADSCs接種后前2d處于潛伏期生長較慢，從第3d開始進入對數(shù)生長期呈S形，約在接種第6天進入平臺期停止增殖，第3代細胞倍增時間為27.4h,不同代數(shù)細胞增殖能力無顯著差異(各

8、培養(yǎng)天數(shù)F值分別為0.14,0.03,0.78,1.14,0.20,0.18,0.18,對應(yīng)P>0.05).見圖2.【1】　　2.