蛋白表達(dá)及純化研究中的FAQ

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1、蛋白表達(dá)及純化研究中的FAQGeneNews基因快訊2004年第3期蛋白農(nóng)達(dá)及純化研究屮的FAQ一、原核蛋白表達(dá)及純化1、怎樣提高E.coli屮6’Ilis標(biāo)簽蛋門的表達(dá)水平?6XIlis標(biāo)簽蛋白的表達(dá)水平低原因可能為:冃標(biāo)蛋白有毒或不穩(wěn)定,或者是細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中不能維持表達(dá)結(jié)構(gòu)。有時(shí)候,插入片段的5,端序列編碼了十?dāng)_轉(zhuǎn)錄或翻譯的元件(比如有反向重復(fù)序列而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu),掩蓋了Shine-Dalgarno序列),在這種情況下,有必要檢查和修改表達(dá)序列。改變培養(yǎng)基和宿主菌也可能會(huì)有所幫助。外源性蛋門的表達(dá)會(huì)使宿主菌生長(zhǎng)遲緩。高速的轉(zhuǎn)錄、翻譯重組蛋口所需要的代謝

2、消耗,導(dǎo)致宿主菌生長(zhǎng)的緩慢。低濃度卜?即影響宿主菌生長(zhǎng)的基因產(chǎn)物被認(rèn)為'有毒',這樣的產(chǎn)物包括細(xì)胞膜蛋白或與DNA相互作川或干擾電了傳遞的蛋白。為了降低有毒蛋白在被誘導(dǎo)前對(duì)宿主菌生長(zhǎng)的影響,在無(wú)誘導(dǎo)的時(shí)候的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平越低越好,并月?誘導(dǎo)前的細(xì)菌傳代數(shù)要控制在最小范圍。細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程屮質(zhì)粒的丟失有時(shí)候可以通過(guò)在培養(yǎng)基小加入高濃度的ampicillin(200ug/ml)或carbonicillin(50ug/m1)得到解決。對(duì)于一些不穩(wěn)定的表達(dá)結(jié)構(gòu),應(yīng)當(dāng)避免過(guò)夜培養(yǎng)起始菌。先從新鮮的培養(yǎng)基上挑選單克隆,少量培養(yǎng)后,2000倍稀釋大量培養(yǎng)。含有疏水基團(tuán)的垂組

3、蛋門往往對(duì)宿主菌有毒性。因此,除非有特殊的意義,應(yīng)當(dāng)去除插入片段屮編碼信號(hào)肽序列或穿膜區(qū)的序列。然而,也有少數(shù)包含信號(hào)肽的蛋門可以在膜間質(zhì)少量的表達(dá)。這種情況下,建議誘導(dǎo)前培養(yǎng)溫度降低為25度。冇些蛋白,尤其是小于lOKDa的蛋白在E.coli中不穩(wěn)定,可能很快被細(xì)菌中的蛋白酶降解。克服這種困難的方法包括:降低培養(yǎng)溫度到30度;使川一種或多種蛋門酶缺陷的宿主菌;使用QIAGEN公司的表達(dá)質(zhì)粒pQE-16、pQE-40,使生成標(biāo)多肽與DHFR的融合蛋白;如果是純化過(guò)程中蛋白易降解,則可以在純化試劑中加入甘油以及蛋白酶抑制劑,并且確保整個(gè)操作在4度完成。2、

4、如何在E.coli中表達(dá)高度毒性的蛋白?在E.coli中表達(dá)高度毒性的蛋白往往是很困難的。毒性基因表達(dá)'泄漏'會(huì)殺死宿主菌,尤其在8期的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)化后,可以使含有突變的不表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)菌選擇性生長(zhǎng)。因此,要表達(dá)高毒性的蛋白,需要更高水平的lac抑制蛋白。推薦同時(shí)使用QIAGEN公司的PQE-80L系列表達(dá)載體和M15[pREP4]宿主菌行pQE-80L系列表達(dá)載體帶有l(wèi)ac抑制了基因,宿主菌M15[pREP4]帶有pREP4質(zhì)粒,兩者持續(xù)的正向或反向高水平表達(dá)lac抑制蛋白。這樣協(xié)同作用,對(duì)以使誘導(dǎo)前的表達(dá)降低到最小的水平,因而提高成功農(nóng)達(dá)毒性蛋白的可能性。

5、3、如何提高E.coli中可溶性蛋白的表達(dá)量?在E.coli屮表達(dá)的真核細(xì)胞蛋門往往形成不可溶的包含體。原因可能包括疏水基團(tuán)的相互作用,半胱氨酸在E.coli胞質(zhì)還原性環(huán)境中不能正確形成二硫鍵。QTAexpress純化系統(tǒng)的-?個(gè)優(yōu)點(diǎn)就在于包含體中帶有6XHis標(biāo)簽的蛋口對(duì)以在變性劑作用下生成可溶性蛋門,然后用Ni-NTA純化。如有必要,變性條件下純化的蛋門可以復(fù)性,重新折疊。盡管如此,很多研究者還是發(fā)現(xiàn)純化過(guò)程中的復(fù)性比較因難。另一個(gè)方法是調(diào)整表達(dá)環(huán)境使生成少最的可溶的天然構(gòu)象的重組蛋門。即使形成了包含體,一些帶6XHis標(biāo)簽的蛋白仍可以在胞質(zhì)中,這些

6、胞質(zhì)中的可溶性蛋白可以在天然的非變性的條件下被純化。如果需要更多的可溶性蛋口,誘導(dǎo)后降低培養(yǎng)溫度會(huì)有所幫助。培養(yǎng)溫度常常直接影響蛋口表達(dá)水平和可溶性,降低溫度可以降低表達(dá)水平從而使可溶性蛋白量增加。另外,也可以在誘導(dǎo)前讓培養(yǎng)物達(dá)到更高的細(xì)胞密度而表達(dá)期控制在最短時(shí)間。IPTG的濃度可以從ImM降低到0.0005mM,使表達(dá)水平降低90%以上。并且,改變宿主菌也可能有效,因?yàn)槟承┚绕渌鷮?duì)某些蛋白的耐受性更好,可以生成更高濃度的可溶性蛋白。最后,很多蛋白需要金屬協(xié)同兇子才能夠保持其對(duì)溶狀態(tài),兇此在培養(yǎng)物中加入金屬鹽對(duì)能會(huì)有幫助。如果不知道蛋白所需的金屬協(xié)

7、同因子,則冇必要測(cè)試不同的添加物。需要注意的是一些二價(jià)的陽(yáng)離子會(huì)影響蛋白與Ni-NTA的結(jié)合。4、如何在使用Ni-NTA純化蛋白過(guò)程中去除富含組氨酸的雜蛋白?在結(jié)合試劑與洗脫試劑屮加入20訕的咪哇(即使在變性條件下),可以抑制雜蛋白的結(jié)介。實(shí)驗(yàn)中逐步提高咪哇的濃度,以確足最佳的去除雜蛋白的濃度。過(guò)量使用Ni-NTA也會(huì)導(dǎo)致非特界性的結(jié)合。因此,對(duì)應(yīng)于預(yù)期的表達(dá)蛋口量來(lái)確定合適的結(jié)合體系,對(duì)以減少非特異蛋白的結(jié)合。很多雜蛋門可能是由于非特異的離子作川引起的,因此純化過(guò)程屮確保在試劑中加入至少300mM的NaCl。雜蛋白也可能與標(biāo)簽蛋白結(jié)合。加入b-ME(到

8、20mM)可以解離雜蛋白與6,His標(biāo)簽蛋白間形成的二硫鍵。這在冃標(biāo)蛋白中包含相

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