香蕉枯萎病菌4號(hào)小種拮抗細(xì)菌的初步篩選及鑒定

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1、香蕉枯萎病菌4號(hào)小種拮抗細(xì)菌的初步篩選及鑒定論文摘要：從香蕉根際土中分離得到87株細(xì)菌菌株，采用平板對(duì)峙法，篩選出7株對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種具有拮抗作用的菌株，并進(jìn)行了抑制枯萎病產(chǎn)4號(hào)小種菌絲生長(zhǎng)和翹子萌發(fā)的試驗(yàn)。結(jié)果顯示，拮抗菌株255、D5、F2、ZK11.214.215.252的發(fā)酵液對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲具有顯著抑制效果，在平板上產(chǎn)生的抑菌圈直徑達(dá)到17.90-22.88mm，并能使病菌菌絲產(chǎn)生畸形或泡囊狀；對(duì)?6子萌發(fā)的抑制率達(dá)到64.40%~80.50%。通過對(duì)3株抑菌作用不同的拮抗

2、菌株的16SrDNA鑒定和生理生化特性鑒定，結(jié)果顯示，拮抗菌株255、D5和F2分別被初步鑒定為蠟狀芽抱桿菌(Bacilluscereus蘇云金芽抱桿(Bacillusthuringiensis)和地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis'論文關(guān)鍵詞：香蕉枯萎病菌，號(hào)小種，拮抗細(xì)菌，基因，鑒定關(guān)鍵詞：香蕉枯萎病菌；拮抗菌；WSrRNA基因；鑒定香蕉枯萎病是由尖抱鐮刀菌古巴?；?Fusariumoxysporumfsp.cubense)侵染而引起香蕉維管束壞死的一種真菌病害。目前在香蕉

3、枯萎病的防治方面，缺乏有效的化學(xué)防治試劑，農(nóng)業(yè)防治措施也不能達(dá)到較理想的效果。因此，生物防治作為一種經(jīng)濟(jì)、安全、有效的防治措施成為了研究的熱點(diǎn)。目前，對(duì)于香蕉枯萎病生物防治的研究主要集中于香蕉枯萎病拮抗菌的篩選及其室內(nèi)盆栽防治試驗(yàn)。Thangavelu等報(bào)道獲得對(duì)香蕉枯萎病的防治效果為48%~51%的哈茲木霉仃richodermaharzianum)，獲得防治效果為4*1%熒光假單抱桿菌(Pseudomonasfluorescens)能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性抑制香蕉枯萎病，枯草芽抱桿菌也有較好的防效。曹理

4、想等報(bào)道，在研究香蕉內(nèi)生曲區(qū)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)幾株玫瑰淺灰鏈霉菌(Streptomycesroseogriseolus)對(duì)香蕉枯萎病菌有一定拮抗作用。本試驗(yàn)旨資助項(xiàng)目：廣東省農(nóng)業(yè)廳(粵農(nóng)函2006-229)★通訊作者.Authorforcorrespondence,E?mail:chunpingyou@sina.com在從香蕉根際土壤中篩選出對(duì)香蕉枯萎病菌具有拮抗作用的生物防治細(xì)菌菌株，并對(duì)其拮抗作用和分類地位進(jìn)行研究，為香蕉枯萎病生物制劑的開發(fā)打下基礎(chǔ)O1材料與方法1.1材料1.1.1供試株香蕉枯萎病菌(Fu

5、sariumoxysporumf.sp.Cubenserace4)由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。1.1.2培養(yǎng)基馬鈴薯肉湯培養(yǎng)基NB配方參考方中達(dá)的方法。1.2方法1.2.1土壤細(xì)菌的分離從不同果園的香蕉植株根際取得土壤樣本，將1g根際土置于滅菌的小三角瓶?jī)?nèi)，加入9ml無菌水稀釋，搖勻成懸浮液，用接菌環(huán)蘸取一環(huán)于NA培養(yǎng)基上劃線分離。289下培養(yǎng)2d,在培養(yǎng)基上挑取不同形態(tài)的單菌落，進(jìn)一步分離純化后，挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行保存。1.2.2拮抗細(xì)菌的初步篩選保存的細(xì)菌單菌落分別接入裝有20mlN

6、B培養(yǎng)液的小三角瓶中，于289振蕩培養(yǎng)24ho拮抗菌的篩選采用對(duì)峙培養(yǎng)法，先將香蕉枯萎病菌菌絲塊接于平板的一側(cè)，再在平板另一側(cè)（與病菌菌絲塊相距3cm）放上浸透細(xì)菌菌液的滅菌濾紙片，于289培養(yǎng)4d后，觀察細(xì)菌對(duì)枯萎病菌的抑制效果，初步篩選出對(duì)香蕉枯萎病菌有抑制效果的拮抗細(xì)菌。1.2.3拮抗細(xì)菌對(duì)香蕉枯萎病菌的抑制作用拮抗細(xì)菌與香蕉枯萎病菌采用對(duì)峙培養(yǎng)的方法，在PDA平板一側(cè)接入于PDA培養(yǎng)基上259下培養(yǎng)5d的香蕉枯萎病菌菌絲塊（05mm）,在相距菌絲塊邊緣3cm處用打孔器打一直徑為5mm的孔，吸取細(xì)

7、菌培養(yǎng)液25pl注入孔中，以注入B培養(yǎng)液為對(duì)照，每處理4次重復(fù)。于28°C培養(yǎng)5d后，觀察細(xì)菌是否具有拮抗效果，并測(cè)量其抑菌圈直徑。1.2.4拮抗細(xì)菌對(duì)香蕉枯萎病菌菌絲的作用方式拮抗細(xì)菌與香蕉枯萎病菌作平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)后，如果拮抗菌對(duì)枯萎病菌產(chǎn)生抑制效果，在抑菌圈的交界處切取菌絲塊，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，研究拮抗細(xì)菌對(duì)香蕉枯萎病菌的作用方式。以病菌菌落邊緣的正常菌絲做為對(duì)照。1.2.5拮抗細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)香蕉枯萎病菌分生抱子萌發(fā)的抑制作用實(shí)驗(yàn)方法參考肖愛萍等方法，12h后觀察抱子萌發(fā)率，根據(jù)下列公式計(jì)算抱子萌發(fā)抑

8、制率：抱子萌發(fā)抑制率（%）=對(duì)照平均鞄子萌發(fā)率?處理電子萌發(fā)率x100對(duì)照平均鞄子萌發(fā)率126拮抗細(xì)菌的16SrDNA序列測(cè)定1.2.2.1CTAB法提取細(xì)菌總基因組DNA,方法參考奧斯伯的方法1.2.2.216SrDNA的擴(kuò)增及測(cè)序：根據(jù)細(xì)菌16SrDNA的保守區(qū)，設(shè)計(jì)PCR引物。上、下游引物序列分別為PrimerF:55-CGGCTACCTTGTTACGAC和PrimerR:5'?GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG,引物由上海生