黃嘌呤氧化酶法測定抗氧化能力.doc

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1、發(fā)酵過程產(chǎn)物形成的測定(SOD活性的測定)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解SOD活性測定的原理2、學(xué)習(xí)黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性二、實(shí)驗(yàn)原理原理：黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在對氨基苯磺酸與甲萘胺作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見光分光光度計(jì)測其吸光度。當(dāng)被測樣品中含SOD時(shí)，則對超氧陰離子自由基有專一性抑止作用，使可形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測定管的吸光度值低于空白管的吸光度值，通過公式計(jì)算可求出被測樣品中SOD的活力。操作步驟：如表2-1。三、實(shí)驗(yàn)試劑硫酸鹽緩沖液，鹽酸羥胺，黃嘌呤，黃嘌呤氧化酶，醋酸等。四、實(shí)驗(yàn)步驟試劑測定管對

2、照管75mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.8）0.550.55待測樣品（ml）A(取樣量)00.1mol/L鹽酸羥胺溶液0.050.0575mmol/L黃嘌呤溶液0.050.050.037U/L黃嘌呤氧化酶0.050.05雙蒸水0.2－A0.2用漩渦振蕩器充分混勻，置37℃恒溫水浴30min。顯色劑（ml）11總體積1.9ml，混勻，室溫放置10min，蒸餾水調(diào)零，測A530五、計(jì)算方法計(jì)算公式：每毫升反應(yīng)液中SOD抑止率達(dá)50％時(shí)對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位（U），待測樣品中的SOD活力由下式計(jì)算：SOD抑制率（％）＝（A2-A1）/A2×100%SO

3、D活力（U/ml）＝（A2-A1）/A2×100%÷50％×反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)×樣本測試前的稀釋倍數(shù)式中：A1:測定管的吸光值；A2:空白管的吸光值六、注意事項(xiàng)：1.試管要洗干凈，在測定微量樣品時(shí)尤為重要。2.要做空白管，并且放在所有測試管的中間做，取平均值。常用試劑（1）誘導(dǎo)劑：分別配制IPTG100μmol/mL；CuSO4·5H2O250μm/mL；ZnSO4100μm/mL。分別于0.22μm濾膜過濾除菌。（2）稀釋菌體所用0.02mol/LpH7.4PBS緩沖液：8.5gNaCl，0.2gKCl，Na2HPO4·12H2O，3.628g，0.27gK

4、H2PO4，定容至1000ml。（3）SOD活性測定①75mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.8）母液配制：A：0.15mol/LK2HPO4配置：準(zhǔn)確稱取17.115gK2HPO4·3H2O溶于500mL蒸餾水中。B：0.15mol/LKH2PO4配置：準(zhǔn)確稱取2.041gKH2PO4溶于100mL蒸餾水中。取母液A91.5mL與母液B8.5mL充分混合后，用水稀釋至終體積200mL，用酸或堿調(diào)pH至7.8。②0.1mol/L鹽酸羥胺溶液（要求新鮮配置）準(zhǔn)確稱取6.949g鹽酸羥胺溶解于1ml蒸餾水中。③75mmol/L黃嘌呤溶液（要求新鮮配置）準(zhǔn)確稱取11.

5、41g黃嘌呤溶于1mlNaOH稀釋液中。NaOH備用液：稱0.8gNaOH溶于50ml水中，使用時(shí)稀釋3倍為0.133mol/LNaOH稀釋液。④0.037U/L黃嘌呤氧化酶溶液（要求新鮮配置，避光）⑤顯色劑配制（避光保存）：A:量取冰醋酸172.5ml于500ml棕色瓶中，稱取0.2g甲萘胺加入冰醋酸中。B：稱取2g對氨基苯磺酸溶于100ml蒸餾水中(對氨基苯磺酸不易溶解，在棕色瓶里用超聲波處理，水溫60－70℃)。C：待對氨基苯磺酸完全溶解后與冰醋酸混合，加蒸餾水至終體積500ml。