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《《不同劑量原兒茶酸對(duì)脂多糖致急性肺損傷小鼠的作用及其機(jī)制研究-論文》.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、242qActaAcadMedWeifangVo1．36No．42014I>急性肺損傷(acutelunginjury，AU)及急性呼吸窘PCA5rag／kg，地塞米松1mg／kg各0．1ml。1h后除對(duì)迫綜合征(ARDS)是重癥監(jiān)護(hù)病房常見的危重癥，隨照組外，其它各組小鼠腹腔注射LPS5mg／kg，對(duì)照組著治療技術(shù)的進(jìn)展及規(guī)范化的保護(hù)性通氣策略的推腹腔注射等體積生理鹽水，造模6h后處死小鼠。廣，ALI的病死率較前有所下降，但仍在較高水平，1．2．2標(biāo)本的制備和處理造模后6h處死小鼠，留嚴(yán)重威脅患者生命。目前臨床上治療AⅡ的藥物主要取小鼠肺臟標(biāo)本、血清及肺泡灌洗液，詳細(xì)操作
2、步驟如有糖皮質(zhì)激素、吸入用一氧化氮、前列腺素E1、N-乙酰下所述：①血清的制備：用10％水合氯醛麻醉小鼠，固半胱氨酸和丙半胱氨酸等，但治療效果尚不能令人滿定好小鼠，立即行眼球取血，標(biāo)本于離心管中靜置意，且存在毒副作用J。近年來中醫(yī)藥在防治ALI方30min，4oC3000r／min離心10min，吸取血清于-80℃凍面取得了一定進(jìn)展，有可能為ALI藥物治療提供新的存?zhèn)溆?。②支氣管肺泡灌洗?BALF)的制備：取血方向。已證實(shí)PCA對(duì)脂多糖(1ip0p01ysaccharide，LPS)后立刻打開胸腔，暴露肺組織，分離肺組織，結(jié)扎右主誘導(dǎo)的ALI有保護(hù)作用J。Toll樣受體4
3、(TLR4)是模支氣管，經(jīng)氣管行左肺肺泡灌洗，用0．5ml高壓滅菌的式識(shí)別受體，可選擇性識(shí)別保守的微生物成分(如病PBS緩沖液緩慢沖洗肺組織3次，回收BALF，回收率毒雙鏈RNA、脂多糖)來啟動(dòng)天然免疫并調(diào)節(jié)獲得性約80％，置于離心管中，4℃3000r／min離心10min，取免疫，當(dāng)環(huán)境因素、病原及前炎癥細(xì)胞因子刺激下巨噬上清液置于一80℃凍存?zhèn)溆?。③肺組織的制備：取下細(xì)胞可迅速上調(diào)TLR的表達(dá)含量_4J。TLR4在炎癥右肺組織并固定右肺上葉。余右肺組織迅速置于液氮中發(fā)揮重要作用，是介導(dǎo)LPS特異性識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中凍存。的重要受體，是LPS上游主要的調(diào)節(jié)器。本課題旨在1．
4、2．3肺組織病理學(xué)觀察取下右肺組織分離右肺進(jìn)一步探討不同濃度原兒茶酸(protocatechuicacid，上葉并置于4％多聚甲醛固定，常規(guī)制備石蠟切片，蘇PCA)預(yù)處理對(duì)ALl小鼠的干預(yù)作用及相關(guān)細(xì)胞因子木精．伊紅(HE)染色，光鏡下觀察病理學(xué)變化。的改變，進(jìn)一步了解PCA對(duì)ALI小鼠的作用機(jī)制，為1．2．4肺組織干質(zhì)量(W／D)比值測定取左側(cè)臨床治療ALI提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。肺葉稱濕質(zhì)量(w)，80℃烤箱中烘烤48h后稱干質(zhì)量1材料與方法(D)，計(jì)算肺組織W／D比值。1．1實(shí)驗(yàn)材料1．2．5酶聯(lián)免疫復(fù)合物法檢測各組小鼠肺泡灌洗液1．1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)昆明小鼠60只，雌
5、雄各半，及血液中TNF一僅，IL一1B的表達(dá)嚴(yán)格按照ELISA試體重(20±2)g，購于山東綠葉制藥有限公司，飼養(yǎng)于劑盒說明，檢測BALF及血液中TNF-儀，IL一1B的表達(dá)，濱州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：魯動(dòng)質(zhì)字終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測450nm處光密度值，并將其與200106003。小鼠分籠喂養(yǎng)于(24-4-1)oC、相對(duì)濕度為標(biāo)準(zhǔn)曲線比較以確定其濃度。40％～80％的室內(nèi)，自由進(jìn)食進(jìn)水，12h光照，適應(yīng)2—1．2．6WesternBlot檢測肺組織中蛋白的表達(dá)稱取3d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、LPS模不同組肺組織，加人細(xì)胞裂解液后在冰上勻漿30min型
6、組、PCA高劑量組、PCA中劑量組、PCA低劑量組、后，4℃14O00r／min離心10min，分裝上清儲(chǔ)存于一地塞米松陽性對(duì)照組，每組1O只。80cC冰箱中，并依照BCA試劑盒要求進(jìn)行蛋白濃度測1．1．2主要藥物及試劑PCA購于南京替斯艾么中定。每組取501xl樣品加上樣緩沖液后95℃煮5min使藥研究所；腫瘤壞死因子僅(TNF．o【)、白介素1B(IL．蛋白變性，而后進(jìn)行10％SDS．PAGE，分離蛋白，并將1B)ELISA檢測試劑盒購于上海朗頓生物科技有限公其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)TBST洗膜后，用5％脫脂奶司；兔抗鼠多克隆抗體TLR4，僅一tublin由巴傲得生物科
7、粉封閉2h，加入TLR4，OL．tublin多克隆抗體4~C過夜。技有限公司提供；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗TBST洗膜3次，每次5min，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的體購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。1．2實(shí)驗(yàn)方法二抗，室溫下于脫色搖床上反應(yīng)1h，經(jīng)TBST洗膜后加1．2．1動(dòng)物分組及模型建立按隨機(jī)數(shù)字表法將小入ECL發(fā)光液反應(yīng)，x光片顯影、定影。膠片掃描后鼠分成正常對(duì)照組、LPS模型組(LPS組)、PCA高劑量用相應(yīng)軟件分析光密度值，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。組(HPCA組)、PCA中劑量組(MPCA組)、PCA低劑1．
