[精品]針刺血清對(duì)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞數(shù)量的影響.doc

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1、針刺血清對(duì)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞數(shù)量的影響針刺血清對(duì)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞數(shù)量的影響［摘耍］目的：探討針刺抑制骨吸收的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。方法：40只12月齡雌性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、針刺預(yù)防組和針刺治療組。針刺預(yù)防組和針刺治療組分別在造模術(shù)后的3d、3個(gè)月開始針刺。取“腎俞”“脾俞”“足三里”“大椎”。自新生SD大鼠四肢長骨分離破骨細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板屮，加入含10%上述各組大鼠血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色并計(jì)數(shù)TRAP(+)多核細(xì)胞數(shù)。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組TRAP(4-)多核細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，針

2、刺預(yù)防組和針刺治療組TRAP(+)多核細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)o結(jié)論：針刺血清能夠減少破骨細(xì)胞的數(shù)量，預(yù)防組和治療組之間的作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)羌異。［工題詞］絕經(jīng)后期；骨質(zhì)疏松/針灸療法；破骨細(xì)胞/針灸效應(yīng);體外發(fā)生絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausalosteoporosis,PM0)是絕經(jīng)后婦女常見的骨代謝性疾病，因其引起骨痛、骨折等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響了絕經(jīng)后婦女的健康和生存質(zhì)量，近年來日益受到廣泛重視。針灸學(xué)者根據(jù)“腎主骨”及“腎為先天之本，脾為后天之本”等中醫(yī)基礎(chǔ)理論，并結(jié)合骨質(zhì)疏松癥“多虛多瘀”的特點(diǎn)，以補(bǔ)腎健脾、活血通絡(luò)為治療原則選穴處方治療絕經(jīng)后

3、骨質(zhì)疏松癥取得了較為滿意的療效，但對(duì)針刺作用的細(xì)胞學(xué)機(jī)制了解甚少。本課題組以往在體實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，針刺可以改善去除卵巢大鼠尿液中與骨吸收相關(guān)的生化指標(biāo)。在上述研究基礎(chǔ)上，本課題組采用體外破骨細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，并借鑒血清藥理學(xué)方法，進(jìn)行了針刺血清對(duì)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞數(shù)量影響的離體實(shí)驗(yàn)研究，目的是進(jìn)一步探討針刺抑制骨吸收作用的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。1材料與方法1.1材料（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)12月齡SD雌性大鼠，體重（407.25±9.26）g（用于制備針刺血清）和新生（1日齡）SD大鼠（用于分離培養(yǎng)破骨細(xì)胞），上海西普爾…必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供［合格證號(hào):SCXK（滬）2003

4、-0002］。（2）主要試劑和儀器：DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司產(chǎn)品），胎牛血清（Hyclone公司產(chǎn)品），蔡酚ASBI磷酸鈉（Sigma公司產(chǎn)品），二甲基二酰胺（Gen-view公司產(chǎn)品），副品紅（上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品），C0₂培養(yǎng)箱（徳國Heraeus公司生產(chǎn)），超凈T作臺(tái)（上海凈化設(shè)備廠生產(chǎn)）,熒光倒置相差顯微鏡（0-lympus）o1.2方法（1）動(dòng)物分組、造模方法與針刺血清制備12月齡SD雌性大鼠40只，其中30只參照文獻(xiàn)方法去除雙側(cè)卵巢后隨機(jī)分為模型組、針刺預(yù)防組和針刺治療組，10只僅去除卵巢附近少量脂肪作為假手術(shù)組。除假手術(shù)組

5、和模型組外，針刺預(yù)防組和針刺治療組分別于去除卵巢術(shù)后3d和3個(gè)月開始針刺。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（大口鼠）常用喻穴簡表及南京中醫(yī)藥研究所華興邦制定的大口鼠取穴標(biāo)準(zhǔn)，取“腎俞”“脾俞”“足三里”“大椎”，電針疏密波，2Hz,強(qiáng)度以大鼠肌肉輕微抖動(dòng)為度，每次15min,隔H1次，10次為一療程，療程間休息5d,兩組均針刺3個(gè)療程。各組大鼠于針刺療程結(jié)束后lh,眼球取血，離心（3000r/min）30min,取血清,同組血清混合,56°C、30mim滅活，經(jīng)0.22/um微孔濾膜過濾除菌，-30°C保存?zhèn)溆谩＃?）破骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)取新生（24h以內(nèi)）SD大鼠用蒸餛

6、水沖冼，75%酒精浸泡2min,于超凈工作臺(tái)上無菌條件下取四肢長骨（股骨、脛骨、肱骨），用磷酸緩沖液（PBS）洗數(shù)次，清除附于骨干上的軟組織及肌肉，置于含有15%胎牛血清的達(dá)爾伯克氏必需基本培養(yǎng)基(DMEM)中將骨干刮碎，將培養(yǎng)液及骨碎片移入離心管，置于旋渦混合器上振蕩lmin,靜置30s,吸取上清細(xì)胞懸液，接種于預(yù)置象牙薄片的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔ImL,再加含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液至2niL,37°C,5%C0₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)o30min后，-棄去培養(yǎng)液，更換為含有10%不同實(shí)驗(yàn)組大鼠血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。24h換液1次。(3)破骨

7、細(xì)胞鑒定通過熒光倒置相差顯微鏡逐R形態(tài)學(xué)觀察、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色以及骨吸收陷窩甲苯胺藍(lán)染色，鑒定所分離培養(yǎng)的細(xì)胞是否為破骨細(xì)胞。(4)TRAP染色陽性多核細(xì)胞計(jì)數(shù)將細(xì)胞懸液種植于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，加入10%不同實(shí)驗(yàn)組血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后，2.5%戊二醛4°C固定，放于孵育液(0.lmol/L醋酸緩沖液18niL、六偶氮副品紅lmL、荼酚AS-BI磷酸鹽20mg,pH5.0)內(nèi)，37°C孵育lh,蒸餡水沖洗，在熒光倒置相差顯微鏡下拍照并隨機(jī)抽取10個(gè)顯微鏡下視野(X250)進(jìn)行TRAP陽性多核細(xì)胞計(jì)數(shù)。(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS12

8、.0統(tǒng)計(jì)軟