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《高效液相色譜培訓(xùn)(HPLC使用與維護(hù)).ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、HPLC的使用與維護(hù)?基本原理和特點?液相色譜儀器部件?實驗操作與應(yīng)用?日常維護(hù)基本原理和特點?基本原理：溶于流動相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時,由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用(吸附,分配,離子吸引,排阻,親和)的大小,強(qiáng)弱不同,在固定相中滯留時間不同,從而先后從固定相中流出.?特點：分離效率高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣、操作自動化。一些商品化儀器檢測器柱溫箱流動相脫氣裝置樣品盤控溫箱四元泵啟動液相色譜儀器的流程l開啟HPLC系統(tǒng)各個設(shè)備的電源打開泵、自動進(jìn)樣器、檢測器電源，待設(shè)備通過自檢后，打開計算機(jī)啟動色譜管理軟件l準(zhǔn)備流動相過濾，脫氣l色譜
2、泵排氣用新配制的流動相灌注泵高效液相色譜儀組成3輸液系統(tǒng)3進(jìn)樣系統(tǒng)3分離系統(tǒng)3檢測系統(tǒng)3數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)自動進(jìn)樣器檢測器色譜泵廢液液相色譜的流動相液相柱---保留值與pH的關(guān)系色譜柱：ZorbaxStableBondC184.6*250mm,5um流動相：27%甲醇：73%磷酸pH：2.5&2.6溫度：50℃流速：1.0mL/min.pH變化值RS變化值0.11.62.流動相類別按流動相組成分：單組分和多組分按極性分：極性、弱極性、非極性按使用方式分：等度洗脫和梯度洗脫對溶劑的要求?水：去離子水自動純水儀純凈水商品瓶裝水?溶劑:色譜純（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，異丙醇）?試劑:
3、分析純?不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新鮮水，水質(zhì)要求越高放置時間越短。?理想的HPLC用水應(yīng)為18.2Ω的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機(jī)物、無機(jī)離子及空氣等。過濾與脫氣l過濾：0.45um或更小孔徑濾膜目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。l脫氣：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡氣泡對測定的影響：1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動流動相的保存l有機(jī)溶劑流動相：室溫下密封，避光保存l緩沖鹽流動相：當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用：低溫下密封保存，一般不超過3天防止微生物生長l有
4、機(jī)溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動相：低溫密封保存防止有機(jī)相的揮發(fā)l選用適宜的容器1．梯度洗脫的特點（1）改善分離,加快分析速度；（2）改善峰形,減少拖尾,有利于痕量組分的檢測；（3）增加峰容量；（4）強(qiáng)烈滯留的組分不容易殘留在柱上,保持柱性能長期良好；（5）下次分析時,流動相需要一段平衡時間；不同溶劑的UV吸收程度稍有差異,可能會引起基線漂移2．梯度洗脫的主要條件強(qiáng)溶劑A%①A流動相/弱溶劑組成；②B流動相/強(qiáng)溶劑組成；③梯度時間；④梯度曲線：線性、凸型或凹型等。time521梯度洗脫321梯度：低壓混合?低壓梯度3用單泵產(chǎn)生梯度，泵前（低壓端）混合3對脫氣要求高3不易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積?
5、如設(shè)計不當(dāng)，梯度的準(zhǔn)確性受影響3滯后體積（系統(tǒng)體積）設(shè)計合理梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響低壓色譜柱B溶劑輸送阻尼器梯AC進(jìn)樣器檢測器度D系統(tǒng)(泵)混合器比例閥滯后(系統(tǒng))體積注意∶滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼死體積/譜帶展寬體積器、混合器及其管路(無色譜柱時)滯后(系統(tǒng))體積高溶劑輸送壓系統(tǒng)(泵)色譜柱梯進(jìn)樣器檢測器度溶劑輸送系統(tǒng)(泵)梯度混合器梯度滯后大小的影響l滯后體積太大會引起梯度變化的延遲3例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min?實際梯度會比設(shè)置值晚2分鐘響應(yīng)，沒有問題3對微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min?實際梯度會比設(shè)置值晚20分鐘響應(yīng)，不能接受l滯后體積的
6、不同會使方法轉(zhuǎn)換麻煩3滯后體積比文獻(xiàn)大或小都會使方法不能重現(xiàn)3滯后體積的變化會導(dǎo)致梯度重現(xiàn)性不好l普通分析型液相色譜的滯后體積為2~4ml滯后體積變化的影響?設(shè)計不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化?滯后體積隨反壓變化的后果：?梯度的準(zhǔn)確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好?用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)梯度百分比梯度百分比不好的梯度梯度曲線滯后曲線好的梯度滯后曲線保留時間保留時間液相色譜的色譜柱色譜柱的連接Stop_depth長度不合適造成柱前死體積色譜柱的連接錐箍錐度不合適造成滲漏可能提高柱效的方法l除去柱上端固定相變色部分
7、(約3mm左右)，再補充新的固定相。l色譜柱吸附未被洗脫成分時，柱效將明顯下降，選合適的溶劑進(jìn)行洗凈。l采用梯度洗脫時，柱在重復(fù)使用前，用泵把幾倍于柱體積的起始溶劑壓經(jīng)柱子，以重新建立起始的平衡來得到再生。HPLC檢測器應(yīng)提供的功能?對樣品有響應(yīng)并有一個輸出信號?應(yīng)該提供在檢測器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計的校正技術(shù)應(yīng)該促進(jìn)這種關(guān)系理想的HPLC檢測器?高靈敏度；可忽略的基線噪音?寬的線性范圍?獨立于流動相及操作參數(shù)的
