hplc高效液相色譜培訓(xùn) ppt

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1、高效液相色譜法HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進(jìn)行比較：第一節(jié)概述1．高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法HPLC優(yōu)點(diǎn)：高速、高效、高靈敏度、高自動(dòng)化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法

2、快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá)10cm3·min-1.如分離苯的羥基化合物，7個(gè)組分只需1min就可完成。對氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長約170cm，柱徑0.9cm，流動(dòng)相速度為30cm3·h-1，需用20多小時(shí)才能分離出20種氨基酸；而用HPLC，只需lh之內(nèi)即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個(gè)組分.第一節(jié)概述2．HPLC與GC(1)GC分析對象只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20％。對于占有

3、機(jī)物總數(shù)近80％的那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用HPLC進(jìn)行分離和分析。(2)GC采用流動(dòng)相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運(yùn)載作用。而HPLC中流動(dòng)相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動(dòng)相對分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個(gè)控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。第一節(jié)概述(3)GC一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而HPLC法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作?？傊琀PLC是吸取了GC與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點(diǎn)，并用現(xiàn)代化手段加以改進(jìn)，因此得到迅猛的發(fā)展。目前H

4、PLC已被廣泛應(yīng)用于分析對生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。HPLC主要缺點(diǎn)：儀器設(shè)備費(fèi)用昂貴，操作嚴(yán)格。第一節(jié)概述3.液相色譜分離原理及分類和GC一樣，LC分離系統(tǒng)也由固定相和流動(dòng)相組成。其固定相可以是吸附劑、化學(xué)鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠；流動(dòng)相是各種溶劑。被分離混合物由流動(dòng)相液體推動(dòng)進(jìn)入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動(dòng)相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進(jìn)行分離。色譜分離的實(shí)質(zhì)是樣品分子（以下稱溶質(zhì)）與溶劑（即流動(dòng)相或洗脫

5、液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色譜過程的保留行為。根據(jù)分離機(jī)制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化合鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型。第一節(jié)概述第二節(jié)高效液相色譜儀器第二節(jié)高效液相色譜儀器一、流程（processofHPLC）首先高壓泵將貯液器中流動(dòng)相溶劑經(jīng)過進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品同時(shí)帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。第二節(jié)高效液相色譜儀器二、主要部件（mainassemblyofHPLC）第二節(jié)

6、高效液相色譜儀器4（6）個(gè)主要部分：高壓輸液系統(tǒng)；脫氣裝置；梯度洗脫；進(jìn)樣系統(tǒng)；分離系統(tǒng)；檢測系統(tǒng)；此外還配有自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等輔助裝置。第二節(jié)高效液相色譜儀器1．高壓輸液系統(tǒng)由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對流動(dòng)相阻力很大，為使流動(dòng)相較快流動(dòng)，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動(dòng)阻力器等組成。高壓輸液泵核心部件。壓力：150～350×105Pa。應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。第二節(jié)高效液相色譜儀器第二節(jié)高效液相色譜儀器常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩

7、種。恒流泵特點(diǎn)：在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)；恒壓泵特點(diǎn)：能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時(shí)間的重視性差。它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機(jī)械泵，它又分機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)泵。第二節(jié)高效液相色譜儀器輸液泵按工作方式分為氣動(dòng)泵和機(jī)械泵兩大類。機(jī)械泵中又有螺旋傳動(dòng)注射泵、單活塞往復(fù)泵、雙活塞往復(fù)泵和往復(fù)式隔膜泵。幾種輸液泵的基本性能見下表。名稱恒流或恒壓脈沖更換流動(dòng)相梯度洗脫再循環(huán)價(jià)格氣動(dòng)放大泵恒壓無