高效液相色譜（HPLC）簡(jiǎn)介課件.ppt

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1、高效液相色譜（HPLC）簡(jiǎn)介HPLC(HighPerformanceLiquidChromatography)—高效液相色譜法是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜,基于儀器方法的高效能分離手段:高性能色譜柱,高精度輸液泵,高靈敏度檢測(cè)器…廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域:醫(yī)藥,環(huán)保,石化,生命科學(xué),食品工業(yè),農(nóng)業(yè)…無論在技術(shù)上,理論上,還是在應(yīng)用上仍處于發(fā)展階段什么是高效液相色譜(HPLC)？液相色譜分析法（一）高效液相色譜分析的流程1、由泵將儲(chǔ)液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測(cè)量之后，導(dǎo)入進(jìn)樣器。2、被測(cè)物由進(jìn)樣器注入，并隨流動(dòng)相通過色譜柱，

2、在柱上進(jìn)行分離后進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)信號(hào)由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理，并記錄色譜圖。3、廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而ＨＰＬＣ改變的是流動(dòng)相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。（二）高效液相色譜的分離過程同其他色譜過程一樣，ＨＰＬＣ也是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。操作過程圖示色譜分離的機(jī)理分離是一個(gè)物理的過程。固定

3、相(StationaryPhase)流動(dòng)相(MobilePhase)樣品(溶解于流動(dòng)相中的溶質(zhì))HPLC的特點(diǎn)項(xiàng)目高效液相色譜法氣相色譜法進(jìn)樣方式樣品制成溶液樣品需氣化或裂解流動(dòng)相溶液惰性氣體分離原理吸附、分配、篩析、親和等吸附和分配檢測(cè)器UVD、PDAD、RID等TCD、FID、ECD等應(yīng)用范圍低、中、高沸點(diǎn)有機(jī)化合物離子型無機(jī)化合物熱不穩(wěn)定化合物生物活性分子低沸點(diǎn)有機(jī)化合物永久性氣體高效液相色譜儀構(gòu)造HPLC的儀器配置及流程檢測(cè)器簡(jiǎn)介（一）◆紫外吸收檢測(cè)器（UVD）原理：用特定波長(zhǎng)的紫外光照射樣品池，通過檢測(cè)透光率的變化來測(cè)定樣品

4、濃度的檢測(cè)器。它具有波長(zhǎng)固定，波長(zhǎng)可變和光二極管陣列三種類型。特點(diǎn)：選擇性檢測(cè)器、對(duì)流量和溫度敏感性低、靈敏度較高（10-9g）?！粽酃庵笖?shù)檢測(cè)器（RID）原理：監(jiān)測(cè)參比池和測(cè)量池中溶液的折射率之差來測(cè)量試樣濃度的檢測(cè)器。特點(diǎn)：通用性檢測(cè)器，溫變化要保持在±0.001℃、靈敏度低（10-6g）。檢測(cè)器簡(jiǎn)介（二）◆電導(dǎo)檢測(cè)器（ECD）原理：監(jiān)測(cè)溶液的電導(dǎo)率變化的檢測(cè)器。特點(diǎn)：選擇性檢測(cè)器、測(cè)量時(shí)要求恒溫、對(duì)流動(dòng)相的組成變化有明顯響應(yīng)、靈敏度低（10-3g）。適用于離子型化合物?！魺晒鈾z測(cè)器（FLD）原理：某些溶質(zhì)在紫外光激發(fā)后能發(fā)射可見

5、光（熒光）的性質(zhì)檢測(cè)。特點(diǎn)：選擇性檢測(cè)器、靈敏度高（10-12g）、對(duì)流量和溫度敏感性低。檢測(cè)器簡(jiǎn)介（三）◆蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）原理：通過檢測(cè)光散射程度而測(cè)定溶質(zhì)濃度的檢測(cè)器。色譜柱后流出物在通向檢測(cè)器途中，被高速載氣（氮?dú)猓﹪姵伸F狀液滴，再進(jìn)入蒸發(fā)漂移管中，流動(dòng)相不斷蒸發(fā)，含溶質(zhì)的霧狀液滴形成不揮發(fā)的微小顆粒，被載氣載帶通過檢測(cè)器。在檢測(cè)器中，光被散射的程度取決于溶質(zhì)顆粒的大小與數(shù)量。特點(diǎn)：消除了溶劑的干擾，不受溫度變化影響，靈敏度高，是通用型檢測(cè)器。紫外吸收檢測(cè)器有三種類型固定波長(zhǎng)紫外吸收檢測(cè)器：低壓汞燈提供固定254nm

6、或280nm紫外光。可變多波長(zhǎng)檢測(cè)器：氘燈做光源，光柵分光光二極管陣列檢測(cè)器photo－diode－arraydetector（PDAD，PDA,DAD）：鎢燈和氘燈組合光源，進(jìn)入檢測(cè)池的不是單色光，而是一段紫外波長(zhǎng)上的光。PDA可以輔助定性。液相色譜分析法的特點(diǎn)在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)了分析速度快、分離效率高和操作自動(dòng)化。兼具分離和分析功能，可以在線檢測(cè)。高效液相色譜法的主要類型及原理1、液-液分配色譜2、液-固吸附色譜3、離子交換色譜4、離子對(duì)色譜5、離子色譜6、排阻色譜7、親和色譜(AC)液-液分配

7、色譜固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相normalphase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。反相鍵合相色譜柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。正相色譜：固定相為極性，流動(dòng)相為非極性。反相色譜：固定相為非極性，流動(dòng)相為極性。用

8、的最多，約占60～70％。液相色譜類型色譜柱簡(jiǎn)介正相柱------固定相通常為硅膠以及其他具有極性官能團(tuán)胺基團(tuán)，如（NH2）和氰基團(tuán)（CN）的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他極性基團(tuán)極性較強(qiáng)，因此，分