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1、第十三章免疫細(xì)胞分離與免疫細(xì)胞功能檢測及應(yīng)用河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科許德英第十三章免疫細(xì)胞的分離與免疫細(xì)胞功能檢測及應(yīng)用第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離一、外周血單個核細(xì)胞分離二、淋巴細(xì)胞的分離三、T細(xì)胞和B細(xì)胞的分離四、T細(xì)胞亞群的分離第二節(jié)淋巴細(xì)胞標(biāo)志及亞群分類一、Ｔ細(xì)胞表面標(biāo)志及亞群二、B細(xì)胞表面標(biāo)志三、NK細(xì)胞表面標(biāo)志第三節(jié)抗原提成細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測一、單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)二、樹突狀細(xì)胞第四節(jié)淋巴細(xì)胞的功能檢測一、T細(xì)胞功能檢測二、B細(xì)胞功能檢測三、NK細(xì)胞活性測定第五節(jié)其他免疫細(xì)胞功能檢測技術(shù)一、中性粒細(xì)胞功能檢測二、巨噬
2、細(xì)胞功能檢測第六節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能檢測的臨床應(yīng)用思考題小結(jié)第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離外周血單個核細(xì)胞分離淋巴細(xì)胞的分離T細(xì)胞和B細(xì)胞的分離T細(xì)胞亞群的分離一、外周血單個核細(xì)胞分離外周血單個核細(xì)胞（peripheralmononuclearcells,PMNC）包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞（monocyte）。Ficoll分離液法主要用于分離外周血中的單個核細(xì)胞，是一種單次差速密度梯度離心的分離法。細(xì)胞分離基本原理不同細(xì)胞密度不同不同細(xì)胞表面生物學(xué)特性不同不同細(xì)胞表面分化抗原不同不同細(xì)胞密度不同人的紅細(xì)胞密度為1.093粒細(xì)胞密度為
3、1.092單個核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）的密度為1.075-1.090不同細(xì)胞密度不同用1.077±0.001的分層液可將細(xì)胞分離分離液的基本要求對細(xì)胞無毒基本等滲不溶于血漿或分離物質(zhì)有一定密度密度梯度離心法（densitygradientcentrifudation)Ficoll（商品名）成份：2份6%聚蔗糖（ficoll)水溶液+1份34%泛影葡胺（hypaque)生理鹽水溶液。最常用的方法，分離純度可達(dá)95%，細(xì)胞獲取率80%。試驗盡量在低溫下進(jìn)行（4℃~8℃或冰?。Ｃ芏忍荻入x心(Ficoll)離心密度梯度分離單個
4、核細(xì)胞（Ficoll分層液）密度梯度分離單個核細(xì)胞（Ficoll分層液）二、淋巴細(xì)胞分離貼壁粘附法吸附柱過濾法磁鐵吸引法Percoll分離液法（連續(xù)密度梯度離心）（去單核細(xì)胞）貼壁黏附法將已制備的單個核細(xì)胞懸液傾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃溫箱靜置1h左右，單核細(xì)胞和粒細(xì)胞均貼于平皿壁上，而未貼壁的非粘附細(xì)胞幾乎為純淋巴細(xì)胞，繼用橡皮刮下貼壁的細(xì)胞即為純單核細(xì)胞群。因B細(xì)胞也有貼壁現(xiàn)象，用本法分離的淋巴細(xì)胞群中B細(xì)胞有所損失。2.吸附柱過濾法將單個核細(xì)胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG10的柱層
5、中，凡有粘附能力的細(xì)胞絕大部分被吸附而粘滯在柱層中，從柱上洗脫下來的細(xì)胞主要是淋巴細(xì)胞。此法簡單易行，對細(xì)胞極少損害。3.Percoll分層液法Percoll(商品名）經(jīng)過聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrolidone,PVP)處理的硅膠顆粒大小不一的混懸液。高速離心后，形成連續(xù)密度梯度，可將密度不同的細(xì)胞分離純化。分離淋巴細(xì)胞純度達(dá)98%，單個核細(xì)胞純度達(dá)78%。流程長、煩瑣、費(fèi)用高。密度梯度分離單個核細(xì)胞（Percoll分層液）E花環(huán)沉降法尼龍毛柱分離法三、T細(xì)胞和B細(xì)胞的分離E花環(huán)分離法T細(xì)胞（CD2/LFA2
6、/E受體）＋綿羊紅細(xì)胞SRBCE花環(huán)比重增加Ficoll-Hypaque分離液分離低滲尼龍棉柱分離法尼龍棉裝入5ml注射器中加入淋巴細(xì)胞懸液37℃、5％CO2、1－2hRPMI1640完全培養(yǎng)基灌洗洗脫液中為T細(xì)胞原理B細(xì)胞可粘附尼龍毛；T細(xì)胞不具有粘附活性。方法評價：實驗室常用分離方法之一簡便、易行獲得細(xì)胞純度較高T細(xì)胞90％B細(xì)胞80％尼龍毛柱法＋E花環(huán)法，T細(xì)胞可達(dá)99％以上四、T細(xì)胞亞群的分離親和板結(jié)合分離法磁性微球分離法熒光激活細(xì)胞分離儀分離法親和板分離法利用親和層析法分離淋巴細(xì)胞亞群，其原理是各種淋巴細(xì)胞亞群具有
7、不同的抗原性，將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上，繼加細(xì)胞懸液，凡抗原陽性的細(xì)胞則與相應(yīng)抗體結(jié)合，抗原陰性的細(xì)胞可從未吸附的細(xì)胞懸液中獲取。同樣若用特異性抗原交聯(lián)在塑料板上，則可分離得具有特異抗原受體的淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞受體與特異抗原或抗體接觸，可引起細(xì)胞激活，因此，凡欲去除細(xì)胞懸液內(nèi)某一細(xì)胞亞群時，本法更適用。如要分離CD4+或CD8+細(xì)胞，則可用抗CD4或CD8單克隆抗體吸附。用抗Ig抗體則可分離B細(xì)胞。同樣，用活化的C3包被，可分離出有C3受體的細(xì)胞。熒光激活細(xì)胞分離儀分離法（五）免疫磁珠法原理：將抗體交聯(lián)于磁珠表面形成免疫磁
8、珠（Immunomagneticbead，IMB）加入細(xì)胞懸液，IMB上的Ab與細(xì)胞表面的Ag反應(yīng)，形成抗體/抗原的復(fù)合物。外加磁場，分選出結(jié)合有免疫細(xì)胞的IMB。直接法抗CD3磁球磁球結(jié)合T細(xì)胞加入B和T細(xì)胞中負(fù)向選擇正向選擇磁架進(jìn)行分離磁珠大小可以選擇大小免疫磁珠分離細(xì)胞的特點(diǎn)比較比較
