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1、第一節(jié)免疫細(xì)胞的分類與分離一、免疫細(xì)胞的種類與特征二、免疫細(xì)胞的分離技術(shù)三、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇一、免疫細(xì)胞的特征1、免疫細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征理化性狀生物學(xué)特性2、免疫細(xì)胞的膜分子特征CD分子NKcells吞噬溶酶體二、免疫細(xì)胞的分離技術(shù)1、密度梯度離心法2、黏附分離法3、熒光激活分離法4、磁性分離法5、其他分離法1、密度梯度離心法聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分層液Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，親水性高，平均分子量為400,000，當(dāng)密度為1.2g/ml仍未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重
2、小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單個(gè)核細(xì)胞。離心前離心后稀釋抗凝血淋巴細(xì)胞分離液血漿單個(gè)核細(xì)胞粒細(xì)胞紅細(xì)胞2、黏附分離法-純淋巴細(xì)胞群的分離貼壁法：將已制備的單個(gè)核細(xì)胞懸液傾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃溫箱靜置1h左右，單核細(xì)胞和粒細(xì)胞均貼于平皿壁上，而未貼壁的非粘附細(xì)胞幾乎為純淋巴細(xì)胞，繼用橡皮刮下貼壁的細(xì)胞即為純單核細(xì)胞群。因B細(xì)胞也有貼壁現(xiàn)象，用本法分離的淋巴細(xì)胞群中B細(xì)胞有所損失。2、黏附分離法：淋巴細(xì)胞亞群的分離尼龍毛法：混合單個(gè)核細(xì)胞懸液在通過尼龍毛柱時(shí)，B細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核
3、細(xì)胞和一些輔助細(xì)胞被選擇性粘附于尼龍毛上，而多數(shù)T細(xì)胞則通過尼龍毛柱，這是獲得富含T細(xì)胞群的有效方法。T細(xì)胞得率為20-30%左右。親和板法：利用親和層析法分離淋巴細(xì)胞亞群，其原理是各種淋巴細(xì)胞亞群具有不同的抗原性，將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上，繼加細(xì)胞懸液，凡抗原陽性的細(xì)胞則與相應(yīng)抗體結(jié)合，抗原陰性的細(xì)胞可從未吸附的細(xì)胞懸液中獲取。吸附柱法：將單個(gè)核細(xì)胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG10的柱層中，凡有粘附能力的細(xì)胞絕大部分被吸附而粘滯在柱層中，從柱上洗脫下來的細(xì)胞主要是淋巴細(xì)胞。此法簡(jiǎn)單易行，對(duì)細(xì)胞極少損害。3、熒光激活分離法（FACS）流式細(xì)胞儀4、磁性分離法（1）磁
4、鐵吸引法：利用單核細(xì)胞具有吞噬的特性，在單個(gè)核細(xì)胞懸液中加直徑為3μm的羰基鐵顆粒，置37℃溫箱內(nèi)短時(shí)旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)，待單核細(xì)胞充分吞噬羰基鐵顆粒后，用磁鐵將細(xì)胞吸至管底，上層液中含較純的淋巴細(xì)胞。（2）磁激活細(xì)胞分離術(shù)MACs：是一種特異性細(xì)胞分選技術(shù)，其高度特異性來自抗體對(duì)抗原的特異性識(shí)別。主要組成成分為MACS微珠、MACS分選柱和MACS分選器。MACS微珠是與高度特異性單克隆抗體相偶聯(lián)的超順磁化微粒。MACS分選柱置于一個(gè)永久性磁場(chǎng)—MACS分選器中，可以將磁力增強(qiáng)1000倍，足以滯留僅標(biāo)記極少量微珠的目的細(xì)胞。用緩沖液沖洗分選柱，所有未標(biāo)記的細(xì)胞被沖洗掉。分選柱離開磁場(chǎng)，即可獲得被標(biāo)
5、記的細(xì)胞組分。MACS(陽性選擇法）NSMACS(陰性選擇法）NS5、其他分離法花環(huán)沉降法：本法是將淋巴細(xì)胞與一定比例的綿羊紅細(xì)胞混合，待淋巴細(xì)胞形成E花環(huán)后，繼用淋巴細(xì)胞分層液分離細(xì)胞。浮懸在分層界面而不形成E花環(huán)的群則富含B細(xì)胞，而沉降在管底的形成E花環(huán)的細(xì)胞用低滲法處理，使圍繞細(xì)胞周圍的綿羊紅細(xì)胞快速裂解，則獲得純的T細(xì)胞?？扇苄訫HC-肽四聚體法：mhc-肽四聚體復(fù)合物的原理是通過增強(qiáng)t細(xì)胞受體與mhc-肽復(fù)合物親和力，達(dá)到可直接特異性檢測(cè)t細(xì)胞的目的。作為臨床診斷工具，定量檢測(cè)外周血及組織中抗原特異性CTLs的比率，并進(jìn)行表型及功能分析。用于過繼性腫瘤免疫治療用于疫苗療效的監(jiān)測(cè)抗
6、原肽-MHC分子四聚體技術(shù)TMHCI類(左)和Ⅱ類(右)分子四聚體結(jié)構(gòu)示意圖三、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇1、細(xì)胞凍存的原理與方法：在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，引起細(xì)胞死亡。向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。2、細(xì)胞復(fù)蘇的原理與方法：細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的－5～0℃，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，活力受損不大。目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對(duì)細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。細(xì)胞凍存罐第二節(jié)免疫細(xì)胞膜分子的檢測(cè)一、免疫細(xì)胞膜分子
7、檢測(cè)的原理與類型二、免疫細(xì)胞膜分子的檢測(cè)方法一、免疫細(xì)胞膜分子檢測(cè)的原理與類型1、以抗體識(shí)別抗原2、以配體識(shí)別受體二、免疫細(xì)胞膜分子的主要檢測(cè)方法1、免疫標(biāo)記檢測(cè)方法熒光抗體法酶免疫檢測(cè)法免疫金銀染色法2、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)（CDC）3、花環(huán)形成試驗(yàn)SmIg的熒光抗體檢測(cè)法SmIg的酶免疫檢測(cè)法補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)（CDC）染料補(bǔ)體E-花環(huán)：利用T細(xì)胞膜上的異種動(dòng)物紅細(xì)胞受體T細(xì)胞B細(xì)胞花環(huán)形成細(xì)胞綿羊紅細(xì)胞EA-花環(huán)
