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1、SeparationandAssaysforImmuneCells免疫細(xì)胞的分離與檢測免疫細(xì)胞的種類淋巴細(xì)胞：T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等單核－巨噬細(xì)胞樹突狀細(xì)胞粒細(xì)胞分離免疫細(xì)胞的樣本來源外周血脾臟淋巴結(jié)胸腺骨髓分離免疫細(xì)胞的目的檢測免疫細(xì)胞的數(shù)量和功能，觀察機(jī)體免疫狀態(tài)免疫細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)研究免疫細(xì)胞的培養(yǎng)和建株分離免疫細(xì)胞的一般原理物理學(xué)和生物學(xué)特征密度大小表面標(biāo)志其它活性：吞噬、黏附等本章主要內(nèi)容1.免疫細(xì)胞的分離與純化2.淋巴細(xì)胞的數(shù)量檢測4.吞噬細(xì)胞功能檢測3.淋巴細(xì)胞的功能檢測第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離與純化白細(xì)胞的分離外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的分離與純化淋巴細(xì)胞亞
2、群的分離細(xì)胞活力的檢測一、白細(xì)胞的分離細(xì)胞密度不同，沉降速度不一樣。粒細(xì)胞1.092,紅細(xì)胞1.093,沉降速度不一樣。自然沉降法(血漿、白細(xì)胞、紅細(xì)胞)聚合物加速沉降法：明膠、右旋糖酐、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。(會增加白細(xì)胞的黏性)二、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離外周血細(xì)胞的密度血小板：1.030-1.035淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞：1.075-1.090粒細(xì)胞：1.092紅細(xì)胞：1.093外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC):Monocyte、Lymphocyte聚蔗糖（Ficoll）－泛影葡胺分層液法（一）原理和方法1.單次密度梯度分
3、離法單次密度梯度連續(xù)密度梯度2.試劑：Ficoll－HypaqueFicoll：聚蔗糖，MW：40000，高密度，低滲透壓、無毒性，6％Ficoll密度為1.020Hypaque：泛影葡糖胺，34％hypaque的密度為1.200，用于調(diào)整分離液的密度。分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞用1.077±0.001的密度分離液。3.離心分離：將細(xì)胞疊加在密度合適的分層液(1.075-1.09)上層，經(jīng)離心后細(xì)胞可分為不同的區(qū)帶。4.收集細(xì)胞5.洗滌、計(jì)數(shù)（二）方法評價(jià)是分離PBMC最常用的方法操作簡單，不需特殊儀器設(shè)備分離純度高，可達(dá)95％細(xì)胞得率高，可達(dá)80％三、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的分離（一）紅細(xì)胞的
4、去除：低滲0.83％NH4Cl處理（二）血小板的去除：離心洗滌；FCS（三）單核細(xì)胞的去除黏附去除法、羰基鐵粉吞噬法（四）Percoll離心法純化淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞單核細(xì)胞的去除黏附去除法：根據(jù)單核細(xì)胞具有黏附作用而去除（培養(yǎng)；凝膠柱）羰基鐵粉法：單核細(xì)胞具有吞噬羰基鐵粉的能力（Ficoll離心；磁鐵）粘附貼壁法單核細(xì)胞－－貼壁生長玻璃、塑料平皿/培養(yǎng)瓶、37℃、1h取未貼壁細(xì)胞------淋巴細(xì)胞（T、B）刮下貼壁細(xì)胞------純單核細(xì)胞缺點(diǎn)：B細(xì)胞也有較弱貼壁，使B細(xì)胞收率↓過柱吸附法層析過柱，單核細(xì)胞滯留于層析柱中洗脫------淋巴細(xì)胞層析柱：玻璃纖維或葡聚糖凝膠粘附能力：Mф
5、、Mon＞DC＞BC＞TC=RBCPercoll分層液法Percoll分層液：經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮處理過的硅膠顆?；鞈乙?，對細(xì)胞無毒、無刺激。Percoll原液加PBS稀釋，高速離心（21000g）連續(xù)密度梯度。將PBMC加在分離液上低速離心后可分離PBMC中的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞亞群的分離E花環(huán)分離法尼龍棉柱分離法補(bǔ)體細(xì)胞毒法親和板結(jié)合分離法免疫磁珠分離法細(xì)胞分選術(shù)E花環(huán)分離法T細(xì)胞（CD2/LFA2/E受體）＋綿羊紅細(xì)胞SRBCE花環(huán)比重增加Ficoll-Hypaque分離液分離低滲尼龍棉柱分離法尼龍棉裝入5ml注射器中加入淋巴細(xì)胞懸液37℃、5％CO2、1－2hRPMI1640完
6、全培養(yǎng)基灌洗洗脫液中為T細(xì)胞原理B細(xì)胞可粘附尼龍毛；T細(xì)胞不具有粘附活性。方法評價(jià)：實(shí)驗(yàn)室常用分離方法之一簡便、易行獲得細(xì)胞純度較高T細(xì)胞90％B細(xì)胞80％尼龍毛柱法＋E花環(huán)法，T細(xì)胞可達(dá)99％以上（三）補(bǔ)體細(xì)胞毒法原理：免疫細(xì)胞表面的某種Ag與相應(yīng)Ab結(jié)合，加入補(bǔ)體，借助補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，破壞Ag陽性的細(xì)胞，收集Ag陰性的細(xì)胞。如：在LC懸液中加入抗人Ig抗體去除B細(xì)胞，得到T細(xì)胞。如：在T細(xì)胞懸液中加入抗CD4抗體去除CD4+T細(xì)胞，得到CD8+T細(xì)胞。親和板分離法（五）免疫磁珠法原理：將抗體交聯(lián)于磁珠表面形成免疫磁珠（Immunomagneticbead，IMB）加入細(xì)胞懸液，
7、IMB上的Ab與細(xì)胞表面的Ag反應(yīng)，形成抗體/抗原的復(fù)合物。外加磁場，分選出結(jié)合有免疫細(xì)胞的IMB。分法：直接法間接法直接法抗CD3磁球磁球結(jié)合T細(xì)胞加入B和T細(xì)胞中負(fù)向選擇正向選擇磁架進(jìn)行分離間接法單克隆抗體CD3羊抗鼠修飾磁球BiomagT細(xì)胞T細(xì)胞免疫磁珠法細(xì)胞分選過程免疫磁珠細(xì)胞分選裝置特點(diǎn):簡便,快速,費(fèi)用低,無需特殊設(shè)備全自動細(xì)胞分選儀MACS法（magneticactivatedcellstoter）SN陰性選擇（負(fù)選
