基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)ppt課件.ppt

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1、第六章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)1限制性內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶DNA修飾酶外切核酸酶單鏈內(nèi)切核酸酶RNA酶2核酸酶：水解相鄰的兩個(gè)核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，從而使核酸分子斷鏈。根據(jù)水解的不同方式，分為：外切核酸酶（exonuclease）內(nèi)切核酸酶（endonuclease）根據(jù)作用的核酸底物不同，分為：RNA酶DNA酶底物非專一性核酸酶36.1限制性內(nèi)切酶定義：限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。41.細(xì)菌限制修飾系統(tǒng)

2、的發(fā)現(xiàn)20世紀(jì)60年代在研究噬菌體的寄主范圍時(shí)發(fā)現(xiàn)的。從天然宿主大腸桿菌K中分離得到的λk噬菌體，當(dāng)其感染B菌株時(shí)，感染率僅為10-4，分離得到幸存的子代λk病毒，再用其感染B菌株，感染率為100%；若再用其感染K菌株，感染率又降為10-4。此現(xiàn)象稱為宿主限制現(xiàn)象。一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)5各種細(xì)菌都能合成一種或幾種能夠切割雙鏈DNA的內(nèi)切核酸酶，以此來限制外源DNA在自身細(xì)胞內(nèi)的存在。幾乎所有的限制性內(nèi)切酶都和能識(shí)別甲基化相同DNA位點(diǎn)的甲基轉(zhuǎn)移酶共同作用，構(gòu)成限制-修飾系統(tǒng)。宿主細(xì)胞的DNA被甲基轉(zhuǎn)移酶修飾而被保護(hù)起來，不被限制性內(nèi)切酶

3、識(shí)別，從而使自身DNA免受降解。62.限制酶HindIII的發(fā)現(xiàn)Smith等于1970年首次從流感嗜血桿菌（H.influenzae）中發(fā)現(xiàn)并分離到HindIII限制酶。3.SV40限制圖譜和轉(zhuǎn)錄圖譜的繪制Nathans（1971年）用HindIII繪制SV40的限制酶譜。7二、限制性內(nèi)切核酸酶的類型已經(jīng)鑒定出的限制性內(nèi)切核酸酶可分為4種不同類型：Ⅰ型酶：能識(shí)別專一的核苷酸序列，并在識(shí)別位點(diǎn)附近的核苷酸切割DNA雙鏈，但切割序列是隨即的，無專一性。在基因工程中應(yīng)用不大。Ⅱ型酶：能識(shí)別專一的核苷酸序列，并在識(shí)別序列的固定位置切割雙鏈DNA分

4、子，是基因工程中最常用的工具酶。8Ⅲ型酶：有專一的識(shí)別序列，但不是對(duì)稱的回文序列，在識(shí)別序列旁邊的位置上切割雙鏈。切割后產(chǎn)生的DNA片段具有各種單鏈末端。Ⅳ型酶：新鑒定出的一種酶，目前無應(yīng)用。9命名原則：屬——種——株——分離序號(hào)例如：EcoRⅠ屬：Escherichia種：coli株：R分離序號(hào)：Ⅰ三、限制性內(nèi)切酶的命名10第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ屬種株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的

5、第三種酶11（一）識(shí)別序列的特異性大多數(shù)Ⅱ型限制內(nèi)切酶的識(shí)別序列長(zhǎng)度為4~6bp，具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的回文序列（palindromicsequence）。四、Ⅱ型限制內(nèi)切酶的基本特性GGATCCCCTAGGBamHⅠ：如果識(shí)別序列由5對(duì)堿基組成，其對(duì)稱軸為中間的一對(duì)堿基，如MaeⅢ的識(shí)別序列為：--GTNAC----CANTC--其中，N為任意堿基。12回文詩悠悠綠水傍林偎，日落觀山四望回。幽林古寺孤明月，冷井寒泉碧映臺(tái)。鷗飛滿浦漁舟泛，鶴伴閑亭仙客來。游徑踏花煙上走，流溪遠(yuǎn)棹一篷開。開篷一棹遠(yuǎn)溪流，走上煙花踏徑游。來客仙亭閑伴鶴，泛舟

6、漁浦滿飛鷗。臺(tái)映碧泉寒井冷，月明孤寺古林幽?；赝纳接^落日，偎林傍水綠悠悠。1314有些限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列中，某一位或二位堿基并非嚴(yán)格專一，但不影響其作用位點(diǎn)，只是增加酶的識(shí)別和作用頻率。如HindⅡ識(shí)別序列為--GTYRAC--，其中Y表示C或T，R表示A或G。有的酶識(shí)別6個(gè)以上的核苷酸序列，稱為稀有限制性內(nèi)切酶，如NotⅠ，識(shí)別序列為（GCGGCCGC）15（二）切割位點(diǎn)的特異性1.DNA分子酶切片段的末端切割：水解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5’端為磷酸基，3’端為羥基。16酶切后產(chǎn)生的片段末端有黏性末端和平末端等

7、形式。黏性末端：DNA分子在限制性內(nèi)切酶的作用下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸形成的末端結(jié)構(gòu)。它們能夠通過互補(bǔ)堿基間的配對(duì)而重新連接起來。17（1）在對(duì)稱軸兩側(cè)相對(duì)位點(diǎn)分別切割一條鏈?？拷?’端切割產(chǎn)生5'端突出的粘性末端，如EcoRI：5'…G▼AATTC…3'EcoRI5'…GAATTC…3'3'…CTTAA▲G…5'3'…CTTAAG…5'5’5’18（2）靠近3'端切割產(chǎn)生3'端突出的粘性末端。如PstI：5'…CTGCA▼G…3'PstI5'…CTGCAG…3'3'…G▲ACGTC…5'3'…GACGTC…5'3’3’195'…C

8、CC▼GGG…3'SmaI5'…CCCGGG…3'3'…GGG▲CCC…5'3'…GGGCCC…5'（3）在對(duì)稱軸中心同時(shí)切割雙鏈，產(chǎn)生平末端或稱鈍性末端（bluntend），如SmaI：20