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1、第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)Enzymes第一節(jié) 限制性內(nèi)切核酸酶—“分子手術(shù)刀”第二節(jié)DNA連接酶——“分子縫合針”第三節(jié)DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶第四節(jié)DNA修飾酶第五節(jié) 外切核酸酶第六節(jié) 單鏈內(nèi)切核酸酶第七節(jié)?。遥危撩负怂崦?nucleases):是指通過切割相鄰兩個(gè)核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，使核酸分子發(fā)生水解斷裂的酶。按底物不同分為：DNA酶（DNase）RNA酶（RNase）底物非專一性核酸酶按作用部位不同分為：5′末端外切酶核酸外切酶3′末端外切酶核酸內(nèi)切酶一、限制－修飾系統(tǒng)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種
2、特定核苷酸序列，并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。.切點(diǎn)：磷酸二酯鍵2.性質(zhì)內(nèi)切酶主要來源于原核生物即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端自我保護(hù)作用3.功能1.來源早在上世紀(jì)60年代Linn和Arber在研究噬菌體的寄主范圍時(shí)發(fā)現(xiàn)如下的現(xiàn)象：分別在E.coli的K菌株和B菌株上生長的λ噬菌體（稱λK和λB）能高效感染各自的宿主;但用λK感染B菌株或用λB去感染K菌株則感染率會(huì)大大降低，這就是限制。如果一旦λK感染B菌株成功則在B菌株中形成的后代也就能高效感染B菌株，再也沒有限制現(xiàn)象，這個(gè)現(xiàn)象稱為修飾。限制和修飾是由宿主控制的，
3、故稱為宿主控制的限制和修飾作用。限制-修飾系統(tǒng)（restriction-modificationsystem）研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌能將外來DNA片段在某些專一位點(diǎn)上切斷，而其自身的染色體DNA由于被一種特殊的酶所修飾而得以保護(hù)，一起構(gòu)成限制-修飾系統(tǒng)。十年后，搞清了細(xì)菌的限制與修飾分子機(jī)理：由三個(gè)基因位點(diǎn)所控制：hsdR,hsdM,hsdShsdR---限制性內(nèi)切酶hsdM---限制性甲基化酶hsdS---控制兩個(gè)系統(tǒng)的表達(dá)1限制性核酸內(nèi)切酶限制（Restriction）限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。1限制性核酸內(nèi)切酶例：M.EcoRI催化
4、s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基轉(zhuǎn)移到EcoRI識(shí)別順序中的第三位腺嘌呤上，從而使DNA免受EcoRI的切割修飾：細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割?，F(xiàn)已從各種微生物中發(fā)現(xiàn)與鑒定出3800余種限制-修飾系統(tǒng)，其中有限制性內(nèi)切核酸酶3819個(gè)、甲基轉(zhuǎn)移酶844個(gè)。現(xiàn)已商品化的限制酶624個(gè)，甲基轉(zhuǎn)移酶32個(gè)。二、限制性內(nèi)切核酸酶的類型Ⅰ型限制性內(nèi)切酶（90個(gè)）目前鑒定出四種不同類型的限制性內(nèi)切酶。Ⅱ型限制性內(nèi)切酶（3714個(gè)）Ⅲ型限制性內(nèi)切酶（12個(gè)）Ⅳ型限制性內(nèi)切酶（3個(gè)）1.I型限制性內(nèi)切酶1968年首先由
5、M.Meselson和R.Yuan在從大腸桿菌B株和K株分離的如EcoB和EcoK（1）識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的特異序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1限制性核酸內(nèi)切酶（2）切割位點(diǎn)在距離特異性識(shí)別位點(diǎn)約1000—1500bp處隨機(jī)切開一條單鏈（3）作用條件需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）1限制性核酸內(nèi)切酶首先由美約翰·霍布金斯大學(xué)的H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來分離的第一個(gè)酶是HindⅡ（識(shí)GTCGAC）（1）識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（
6、多數(shù)是回文序列）,與DNA的來源無關(guān)2.II類限制性內(nèi)切酶1限制性核酸內(nèi)切酶（2）切割位點(diǎn)識(shí)別位點(diǎn)處切開雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）如：EcoRI5’-G?AATTC-3’3’-CTTAA?G-5’PstI5’-CTGCA?G-3’3’-G?ACGTC-5’產(chǎn)生粘性末端EcoRV5’-GAT?ATC-3’3’-CTA?TAG-5’產(chǎn)生平齊末端1限制性核酸內(nèi)切酶（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端分兩種類型：①5’端凸出（如EcoRI切點(diǎn)）1限制性核酸內(nèi)切
7、酶②3’端凸出（如PstI切點(diǎn)）3.III類限制性內(nèi)切酶在完全肯定的位點(diǎn)切割DNA（一般在識(shí)別位點(diǎn)24-26bp），但反應(yīng)需要ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸）。EcoP1:AGACC——EcoP15:CAGCAG——在基因工程操作中用途不大1限制性核酸內(nèi)切酶I類內(nèi)切酶II類內(nèi)切酶III類內(nèi)切酶限制和修飾活性雙功能的酶內(nèi)切酶和甲基化酶分開雙功能酶內(nèi)切酶的蛋白結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單一亞基2種不同的亞基限制作用所需要的輔助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特異性位點(diǎn)識(shí)別序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6
8、GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG
