基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)

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1、第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)限制性內(nèi)切酶第二節(jié)DNA連接酶第三節(jié)DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶第四節(jié)DNA修飾酶第五節(jié)外切核酸酶第六節(jié)單鏈內(nèi)切核酸酶第七節(jié)RNA酶核酸酶：通過(guò)切割相鄰的兩個(gè)核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，從而導(dǎo)致核酸分子多核酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶?；靖拍罴捌渖锕δ芴禺愃鈹嗔裄NA分子，核糖核酸酶（RNase）特異水解斷裂DNA分子，脫氧核糖核酸酶（DNase）非專一性酶，底物或者為DNA或者為RNA從核酸分子末端逐個(gè)降解核苷酸，叫外切核酸酶從核酸分子內(nèi)部切割磷酸二酯鍵使之?dāng)嗔研纬尚∑?，叫?nèi)切核酸酶按水解斷裂核酸分子的方式:根據(jù)作用的核酸底

2、物不同:基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶(如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶，DNA聚合酶等)作為工具對(duì)基因進(jìn)行人工切割，拼接和擴(kuò)增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶”。工具酶1、限制-修飾系統(tǒng)2、限制性核酸內(nèi)切酶的命名和類型3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素5、限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA的消化作用第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶限制性內(nèi)切核酸酶(Restrictionendonuclease)是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切酶概念2.性質(zhì)內(nèi)切酶

3、主要來(lái)源于原核生物即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端自我保護(hù)作用3.功能細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）1.來(lái)源任何一種生物體都存在防御外界物質(zhì)進(jìn)入的機(jī)制大腸桿菌B大腸桿菌Kphageλ(B)EOP=10-4（限制作用）EOP=10-4（限制作用）EOP=1（修飾作用）修飾的phageλ(K)人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡(jiǎn)稱（R/M體系）。細(xì)菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來(lái)的DNA，并能使后者降解掉。寄主的限制與修飾現(xiàn)象E.O.P成斑率effici

4、encyofplatingEOP=1限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA進(jìn)行分解，切成小片斷。（1）限制（Restriction）限制作用:實(shí)際就是限制性內(nèi)切酶降解外源DNA，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割。（2）修飾（Modification）①Dam甲基化酶(DNAAdenineMethylase)GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶(DNAcytosineMethylase)CCAGG或CCTGG序列在第二個(gè)C上C5位置上引入甲基修飾作用:宿主細(xì)胞通過(guò)甲基化作

5、用達(dá)到識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來(lái)遺傳物質(zhì)的目的。（3）限制與修飾系統(tǒng)相關(guān)的三個(gè)基因①hsdR:編碼限制性內(nèi)切酶②hsdM:編碼限制性甲基化酶③hsdS:編碼限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的協(xié)同表達(dá)這類酶能識(shí)別DNA分子上的特定位點(diǎn)，并將雙鏈DNA切斷這類酶使DNA分子特定位點(diǎn)上的堿基甲基化，即起修飾DNA的作用。作用是協(xié)同上述兩種酶識(shí)別特殊的作用位點(diǎn)。2.入噬菌體長(zhǎng)期生長(zhǎng)在大腸桿菌宿主細(xì)胞K株，B株中，1）宿主細(xì)胞甲基化酶，將染色體DNA和噬菌體DNA特異性保護(hù).2）封閉自身所產(chǎn)生的核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)------（修飾）1.大腸桿菌宿主細(xì)胞K株，B株，有各自的限制

6、和修飾系統(tǒng)。限制和修飾作用的分子機(jī)制3.外來(lái)DNA入侵時(shí)，遭到宿主限制性內(nèi)切酶的特異降解------（限制）4.由于降解不完全，外來(lái)少數(shù)DNA分子在宿主細(xì)胞中繁殖過(guò)程中被宿主細(xì)胞的甲基化酶修飾，雖然是外來(lái)卻不被降解。5．接受了新宿主菌甲基化修飾的同時(shí)，喪失了原宿主菌修飾的標(biāo)記，喪失在原宿主細(xì)胞中的存活能力?；蚬こ讨校瑧?yīng)采用缺少限制作用的菌株作為受體。1、限制-修飾系統(tǒng)2、限制性核酸內(nèi)切酶的命名和類型3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素5、限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA的消化作用第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶1973年H.OSmith和D.N

7、athans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：限制性內(nèi)切酶的命名用屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)字母的略語(yǔ)表示寄主菌的物種名，組成酶的基本名稱。大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示2.如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將該菌株名的第一個(gè)字母加在基本名稱后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則用一個(gè)大寫(xiě)字母表示此染色體外遺傳成分。如HindⅡ：d菌株EcoRI：抗藥性R質(zhì)粒3.如果一種特殊的菌株內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示該菌株中發(fā)現(xiàn)某種酶

8、的先后次序。如HindⅡ：d菌株中發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)酶4.所有的限制酶，除以上名稱外還