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1、第二章——基因工程的酶學基礎一、K菌株和B菌株中有一種限制系統，可以排除外來的DNA。C菌株不能限制來自B菌珠的DNA。這種限制作用就是限制酶降解外源DNA，維護宿主遺傳穩(wěn)定的保護機制。二、限制酶的功能1、降解外源DNA，從而阻止其復制和整合到宿主細胞中。2、修飾酶的功能。3、對自身某個堿基進行甲基化，從而保護自身的DNA不被降解。三、概念1、核酸酶：通過切割相鄰的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，從而導致核酸分子多核苷酸鏈發(fā)生水解斷裂的酶。2、核酸內切酶：從核酸分子內部切割磷酸二酯鍵使之斷裂成小片斷。3、核酸外切酶：從核酸分子的末端開始逐個地切割降解核苷酸。4、限制性核酸內切酶(restricti
2、onendonuclease）：一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并切割DNA雙鏈結構的內切核酸酶。四、限制酶的分類:根據其識別和切割序列的特性，催化條件及修飾活性等，一般將限制酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三類。廣義指上述三個系統中的限制酶；狹義指II型限制酶。五、三類限制性內切酶的比較特性I型酶II型酶III型酶限制和修飾?雙功能酶內切酶與甲基化酶分離雙能酶識別位點非對稱序列回文對稱結構非對稱序列切割位點在距識別位點至1000bp處隨機切割識別位點上距識別位點24–26bp處序列特異性切割否是是分子克隆中應用無廣泛很少六、限制酶的命名原則：第一個字母，大寫，來源宿主屬名的一個字母；第二、
3、三個字母，小寫，取自種名的頭2個字母；第四個字母，大寫，取自它來菌株系；最后用羅馬數字大寫，代表同一菌株中不同限制酶的編號。前3個字母斜體例：E.coRIE為大腸桿菌的屬名(escherichia)的第一個字母co.種名(coli)的頭兩個字母R表示所用大腸桿菌的菌株I表示該細菌中分離出來的這一類酶的編號E．ColiRyel3株分離到EcoRI,EcoRII，EcoRV七、限制酶識別序列。限制酶在dsDNA上能夠識別的特殊核苷酸序列。E.coRIGAATTC。HindIIIAAGCTT。Sau3AGATC。Dra3IIPuGGNCCP，Pu代表A或G。Py代表T或C。N代表任意堿八、偶數核苷酸
4、組成的識別序列，以中線為軸，兩側核苷酸互補對稱。E.coRIGAATTC、CTTAAG。奇數核苷酸組成的識別序列，以N為軸，兩側核苷酸互補對稱。GTNAC、CANTG根據識別序列的規(guī)律性，找可能的識別序列。偶數序列，先找GC、CG、AT、TA，然后找其兩側的核苷酸NGCN、NATN、NCGN、NTAN。奇數序列，先找GNC、CNG、ANT、TNA，然后找其兩側的核苷酸。NGNCN、NANTN、NCNGNNTNAN.九、一般說，在同一個DNA分子中，識別序列短的出現的概率大，反之概率小。原則上有n個堿基的識別序列的出現概率是1/4n。如Sau3A識別序列GATC，間隔256(44)個核苷酸就有一
5、次機會出現這個識別序列。十、在一個環(huán)狀DNA分子上，若某種限制酶有n個識別序列，經完全酶切后產生n個DNA片段在一個線性DNA分子上，若某種限制酶有n個識別序列，經完全酶切后產生n+1個DNA片段十一、富AT的識別序列在富AT的DNA分子中出現的概率高，在富GC的DNA分子中出現的概率低。出現概率低的限制性核酸內切酶稱稀切酶(rarecuttingenzymes)。十二、有的限制酶可識別兩種以上的核苷酸序列。例：AccI：GTATAC、GTCGAC。DdeI：CTAAG、CTTAG、CTGAG、CTCAG十三、切割位點：dsDNA在限制酶的作用下，使多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷開的位置。一般用“
6、/”或“↓”表示。具體位置：在識別序列內部或兩側。例：①G↓GATCC②AT↓CGAT③↓GATC④CATC↓十四、黏性末端(stickyend)：DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互補堿基的單鏈延伸形成的末端結構，它們能通過互補堿基間的配對而重新連接起來。有5‘端黏性末端、3‘端黏性末端。平末端(bluntend):若限制酶在識別序列的對稱軸上切割，形成的片段末端為平末端。核苷酸奇數的識別序列被相應的限制酶切割后，產生的末端都是黏性末端。核苷酸偶數的識別序列被相應的限制酶切割后，產生的末端可粘可平。十五、由于限制酶要求嚴格的識別和切割序列，在一段不大的DNA片段中，酶切位點是不多的，酶切產
7、物片段的大小和數目也是固定的。此特性可用于鑒定酶種類和活性測定，也用于鑒定DNA片段是否有同源性，或有無變異。十六、①同裂酶：定義：來源不同，能識別相同序列的限制酶。特點：1）識別序列相同2）切割位點可能不同。②同序同切酶：識別序列和切割位點都相同。HindII與HincIIGTY/RAC。HpaII與HpaIIC/CGG。③同序異切酶：識別序列相同，但切割位點不同。KpnIGGTAC/CAcc6
