基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)(II)

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1、第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)Enzymes工具酶種類:RestrictionendonucleaseDNAligaseDNApolymeraseDNAprosessingenzyme一、限制性核酸內(nèi)切酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（4—8bp），并在相關(guān)位置切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。（Restrictionendonuclease）I型限制性內(nèi)切酶目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)切酶。二、限制性內(nèi)切酶的類型II類限制性內(nèi)切酶III類限制性內(nèi)切酶M.Meselson和R.Yuan在19

2、68年從大腸桿菌B株和K株分離的。（1）識別位點序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.I型限制性內(nèi)切酶如EcoB和EcoK。未甲基化修飾的特異序列。需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（3）作用機理距離特異性識別位點約400-7000bp，切割序列沒有專一性。Recognizesitecut400-7000bp（2）切割位點2.III類限制性內(nèi)切酶識別位點嚴格專一（不是回文結(jié)構(gòu)），但切點不專一，往往不在識別位點內(nèi)部。反應(yīng)需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）,數(shù)量較少。在

3、基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG24-26bp未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列--palindrome）。3.II類限制性內(nèi)切酶形成stickyend或bluntend識別位點嚴格專一，識別位點或兩側(cè)處切割。EcoRI5’-G?AATTC-3’3’-CTTAA?G-5’產(chǎn)生粘性末端EcoRV5’-GAT?ATC-3’3’-CTA?TAG-5’產(chǎn)生平齊末端（1）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有幾個核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：①5’

4、端凸出（如EcoRI切點）G?AATTCCTTAAGGAATTCCTTAA?G5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCA?G②3’端凸出（如PstI切點）G?ACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAGGACGTC連接便利（2）粘性末端的意義不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補就可以連接。同一個DNA分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。異源同工酶:來源不同，但具有相同的識別序列的限制性內(nèi)切酶。（3）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶：識別序列和切點

5、完全相同。HindⅢ5’-A?AGCTT-3’3’-TTCGA?A-5’HsuI5’-A?AGCTT-3’3’-TTCGA?A-5’XmaI5’-C?CCGGG-3’3’-GGGCC?C-5’SmaI5’-CCC?GGG-3’3’-GGG?CCC-5’識別位點相同，但切點不同。酶切后產(chǎn)生不同的DNA末端。②不完全同裂酶：來源不同，識別序列不同，但是切割DNA分子所得的DNA片段具有相同的粘性末端。（4）同尾酶(Isocaudamer）5’-G?GATCC-3’3’-CCTAG?G-5’BamHIBclI5’-T?GATCA

6、-3’3’-ACTAG?T-5’5’-A?GATCT-3’3’-TCTAG?A-5’BglⅡ5’-U?GATCY-3’3’-YCTAG?U-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。5’-?GATC----3’3’----CTAG?-5’Sau3A同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點一般(不能or能？)再被原來的酶識別。5’-G3’-CCTAGGATCT-3’A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3Ahybridsite雜交位點（hybridsite）：同尾酶切割DN

7、A產(chǎn)生的末端連接后所形成的新的位點。焊死：同尾酶產(chǎn)生的粘性末端連接后，不能用任何一種酶酶切。（5）識別位點在DNA分子中的頻率假定核苷酸隨機排列，四堿基酶大約256個核苷酸有一個識別序列，而六堿基的酶大約有4096個核苷酸有一個識別序列。λDNA長49kb，對于六堿基的酶應(yīng)該有（）個切割位點？理論上有n個核苷酸的識別序列的酶出現(xiàn)概率為（）。121/4n（6）II型限制性內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的條件大部分需要相似的反應(yīng)條件Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mM0-50mM低鹽酶NaCl0-150mM50-100mM中鹽

8、酶DTT（二硫蘇糖醇）1mM100-150mM高鹽酶Volume20-100ulT37℃>1hr一部分為50-65℃，少數(shù)25-30℃DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。1.DNA的純度三、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素①純化DNA②加大酶的用量1ugDNA用10U酶③延長