蘭州大學(xué)基因工程基因工程酶學(xué)基礎(chǔ)

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1、第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶主要來源于原核生物1968年，Dr.WernerArber,Dr.DanielNathan和Dr.HamiltonSmith博士第一次從大腸桿菌中提取出限制性內(nèi)切核酸酶已經(jīng)分離提取出500多種限制性內(nèi)切核酸酶1、來源及發(fā)現(xiàn)Dr.WernerArber內(nèi)切酶，即在核酸分子內(nèi)部制造切口的酶形成5`-P和3`-OH末端2性質(zhì)3功能自我保護(hù)作用細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）a限

2、制（Restriction）限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA分子進(jìn)行分解，切成小片段AABBBBBb修飾（Modification）細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割c限制修飾系統(tǒng)分子機(jī)理由三個(gè)連續(xù)基因位點(diǎn)所控制：hsdR,hsdM,?hsdShsdR---限制性內(nèi)切酶:能識(shí)別DNA分子上的特定位點(diǎn)并將雙鏈DNA切斷hsdM---限制性甲基化酶:催化DNA分子特定位點(diǎn)上的堿基甲基化反應(yīng)hsdS---控制兩個(gè)系統(tǒng)的表達(dá):協(xié)助上述兩種酶識(shí)別特殊的作用位點(diǎn)宿主細(xì)胞內(nèi)的甲基化酶將自身DNA和噬菌體DNA實(shí)施特異性保護(hù)，封閉了自身

3、限制性酶的識(shí)別位點(diǎn)這種限制不完全，總有少數(shù)入侵DNA會(huì)存活，得以在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并被宿主的甲基化酶修飾，但同時(shí)，也喪失了原宿主甲基化酶標(biāo)記d意義寄主控制的限制與修飾是一種廣泛的過程，廣泛存在于原核細(xì)菌中。有兩方面作用：保護(hù)自身DNA不受限制破壞外源DNA，使之迅速降解二限制性內(nèi)切酶的命名命名：EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：酶編碼基因所在質(zhì)粒；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序)三限制性內(nèi)切酶類型目前鑒定出3種不同的限制性內(nèi)切酶I型限制性內(nèi)切酶II型限制性內(nèi)切酶Ⅲ型限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶的類型及其主要特性II型限制性內(nèi)切酶的基本特性1970年，由H.O.smith和K.W.wilc

4、ox從流感嗜血菌中分離得到如HindII（1）識(shí)別位點(diǎn)未甲基化修飾的特異靶序列，多數(shù)呈中心對(duì)稱的回文結(jié)構(gòu)，由4-8個(gè)堿基組成，有些識(shí)別位點(diǎn)是連續(xù)的，有些則是間斷的，如GANTC（2）切割位點(diǎn)絕大多數(shù)II類酶在其識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)切割DNA粘性末端（cohensiveend）連接便利DNA分子末端標(biāo)記平末端補(bǔ)齊一把特殊的剪刀—限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)同裂酶(isoschizomers)：來源不同，識(shí)別的是同樣的核苷酸靶序列同尾酶(isocaudamer)：來源不同，識(shí)別的靶序列也各不相

5、同,但都能產(chǎn)生相同的粘性末端由同尾酶所產(chǎn)生的DNA片段，是能夠通過其粘性末端之間的互補(bǔ)作用而彼此連接起來的，在基因克隆實(shí)驗(yàn)中很有用處由一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)，稱之為“雜種位點(diǎn)”(hybridsite)。但這類雜種位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，一般不再被原來的任何一種同尾酶所識(shí)別影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1、DNA的純度2、DNA的甲基化程度3、酶切反應(yīng)的溫度4、DNA的分子結(jié)構(gòu)5、核酸限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液DNA的純度DNA的甲基化程度原核生物限制—修飾體系，對(duì)識(shí)別序列中特定核苷酸的甲基化，會(huì)強(qiáng)烈影響酶活性。在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大腸桿菌，在選用酶時(shí)

6、應(yīng)注意：所選用的限制酶對(duì)甲基化的敏感性依DNA的不同來源選擇不同的限制酶反應(yīng)溫度大多數(shù)的核酸限制內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度為37℃，但也有許多例外，如SmaI為25℃，ApaI為30℃，TaqI為65℃消化反應(yīng)溫度高于或低于最適反應(yīng)溫度，都會(huì)影響酶的活性每ugDNA用1-5U酶切1-2hDNA的分子結(jié)構(gòu)某些核酸內(nèi)切酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需的酶量比消化線性DNA高出20倍一些核酸內(nèi)切酶，切割處于不同位置的限制位點(diǎn)，其效率有明顯的差異，可能是由于側(cè)翼序列的核苷酸成分的差異造成的有些特定的限制位點(diǎn)，只有當(dāng)其它的限制位點(diǎn)被廣泛切割時(shí)，才能被有關(guān)的核酸限制性內(nèi)切酶消化少

7、數(shù)酶，如SacII對(duì)不同部位的限制位點(diǎn)的切割活性會(huì)有很大的差異，其中有些位點(diǎn)很難被切割核酸限制性內(nèi)切酶的緩沖液核酸內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液組分：MgCl2、NaCl/KCl、Tris-HCl、巰基乙醇或DTT以及BSA等NaCl或Mg2＋濃度：降低酶的活性，導(dǎo)致識(shí)別序列特異性改變Tris-HCl:穩(wěn)定反應(yīng)液的pH在酶的最佳pH范圍內(nèi)巰基試劑：保持酶的穩(wěn)定性，避免失活Na、K離子：對(duì)部分酶反應(yīng)敏感，部分酶則適應(yīng)較廣的離子強(qiáng)度的變化幅度酶解反應(yīng)中的星號(hào)活性星號(hào)活性（staractivity）當(dāng)酶反應(yīng)體系發(fā)生改變時(shí)，酶的性能甚至酶切位點(diǎn)發(fā)生改變的現(xiàn)象