第二章_基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ).ppt

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1、生命科學(xué)學(xué)院第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴(lài)一些酶(如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶，DNA聚合酶等)作為工具對(duì)基因進(jìn)行人工切割，拼接和擴(kuò)增等操作。所以把這些酶稱(chēng)之為“工具酶”。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第二章　基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié)　限制性核酸內(nèi)切酶第二節(jié)DNA連接酶第三節(jié)DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶第四節(jié)DNA修飾酶第五節(jié)　外切核酸酶第六節(jié)　單鏈內(nèi)切核酸酶第七節(jié)RNA酶生命科學(xué)學(xué)院本章重點(diǎn)掌握的內(nèi)容限制性核酸內(nèi)切酶、同裂酶、同尾酶、星星活性。II型限制性核酸內(nèi)切酶命名原則、操作注意事項(xiàng)及產(chǎn)生星活性的原因、影響酶活性的因素。DNA聚合酶的種類(lèi)及性質(zhì)其它常用工具酶的功

2、能及其用途。生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶任何一種生物體都存在防御外界物質(zhì)進(jìn)入的機(jī)制限制/修飾系統(tǒng)(R-M,Restriction-modificationsystem)生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶大腸桿菌B大腸桿菌K修飾的phageλ(B)EOP=10-4（限制作用）EOP=10-4（限制作用）EOP=1（修飾作用）修飾的phageλ(K)人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡(jiǎn)稱(chēng)（R/M體系）。細(xì)菌的R/M體系類(lèi)似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來(lái)的DNA，并能使后者降解掉。一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象EOP???Efficiency

3、?of?plate成斑率生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象限制(restriction)：指一定類(lèi)型的細(xì)菌可以通過(guò)限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導(dǎo)致噬菌體的寄主幅度受到限制。限制作用:實(shí)際就是限制性?xún)?nèi)切酶降解外源DNA，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象修飾(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通過(guò)甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修飾，從而免遭自身限制性酶的破壞。修飾作用:宿主細(xì)胞通過(guò)甲基化作用達(dá)到識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來(lái)遺傳物質(zhì)的目的。生命科學(xué)學(xué)

4、院第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象1968Linn和Arber從E.coliB中發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅰ1970Smith（美）在流感嗜血桿菌發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅱ1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因發(fā)現(xiàn)限制性?xún)?nèi)切酶及對(duì)其功能研究的突出貢獻(xiàn)獲得諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象寄主控制的限制與修飾的作用一是保護(hù)自身的DNA不受限制；二是破壞外源DNA使之迅速降解?；蚬こ讨?，應(yīng)采用缺少限制作用的菌株作為受體。生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶二、限制性?xún)?nèi)切酶的類(lèi)型限制性核酸內(nèi)切酶（限制性酶）：在細(xì)胞內(nèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸

5、序列，并對(duì)DNA分子進(jìn)行切割的一種酶。據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修飾蛋白結(jié)構(gòu)輔助因子識(shí)別序列切割位點(diǎn)雙功能（具甲基化）異源三聚體ATPMg2+SAM距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)性切割單一功能同源二聚體Mg2+4-6bp回文序列識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割雙功能（具甲基化）異源二聚體ATPMg2+距識(shí)別序列下游24-26bp處隨機(jī)性切割基因工程中使用注：SAM為S－腺苷甲硫氨酸生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶1.I型限制性?xún)?nèi)切酶首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年從大腸桿菌B株和K株分離的。如EcoB

6、和EcoK。（1）識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的特異序列。EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（2）切割位點(diǎn)在距離特異性識(shí)別位點(diǎn)約1000—1500bp處隨機(jī)切開(kāi)一條單鏈。（3）作用機(jī)理需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。Recognizesitecut1-1.5kb生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶2.II類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來(lái)。分離的第一個(gè)酶是HindⅡ（1）識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列），與DNA的來(lái)源無(wú)關(guān)。A

7、BCC’B’A’A’B’C’CBAA’B’N’BAABNB’A’或生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶（2）切割位點(diǎn)識(shí)別位點(diǎn)處。切開(kāi)雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：EcoRI5’-G?AATTC-3’3’-CTTAA?G-5’PstI5’-CTGCA?G-3’3’-G?ACGTC-5’產(chǎn)生粘性末端EcoRV5’-GAT?ATC-3’3’-CTA?TAG-5’產(chǎn)生