基因工程酶學基礎

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1、第二章基因工程的酶學基礎第一節(jié)限制性內切酶第二節(jié)DNA連接酶第三節(jié)DNA聚合酶和反轉錄酶第四節(jié)DNA修飾酶第五節(jié)外切核酸酶第六節(jié)單鏈內切核酸酶第七節(jié)RNA酶核酸酶：通過切割相鄰的兩個核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，從而導致核酸分子多核酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶?；靖拍罴捌渖锕δ芴禺愃鈹嗔裄NA分子，核糖核酸酶（RNase）特異水解斷裂DNA分子，脫氧核糖核酸酶（DNase）非專一性酶，底物或者為DNA或者為RNA從核酸分子末端逐個降解核苷酸，叫外切核酸酶從核酸分子內部切割磷酸二酯鍵使之斷裂形成小片段，叫內切核酸酶按水解斷裂核酸分子的方式:根據(jù)作用的核酸底

2、物不同:基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶(如限制性核酸內切酶，連接酶，DNA聚合酶等)作為工具對基因進行人工切割，拼接和擴增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶”。工具酶1、限制-修飾系統(tǒng)2、限制性核酸內切酶的命名和類型3、II型限制性核酸內切酶的基本特性4、影響限制性內切酶活性的因素5、限制性內切酶對DNA的消化作用第一節(jié)限制性核酸內切酶限制性內切核酸酶(Restrictionendonuclease)是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此處切割DNA雙鏈的核酸內切酶。限制性核酸內切酶概念2.性質內切酶

3、主要來源于原核生物即在核酸分子鏈的內部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端自我保護作用3.功能細菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）1.來源任何一種生物體都存在防御外界物質進入的機制大腸桿菌B大腸桿菌Kphageλ(B)EOP=10-4（限制作用）EOP=10-4（限制作用）EOP=1（修飾作用）修飾的phageλ(K)人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡稱（R/M體系）。細菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解掉。寄主的限制與修飾現(xiàn)象E.O.P成斑率effici

4、encyofplatingEOP=1限制性內切酶將侵入細菌體內的外源DNA進行分解，切成小片斷。（1）限制（Restriction）限制作用:實際就是限制性內切酶降解外源DNA，維護宿主遺傳穩(wěn)定的保護機制。細菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護，不能被自身的限制性內切酶識別切割。（2）修飾（Modification）①Dam甲基化酶(DNAAdenineMethylase)GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶(DNAcytosineMethylase)CCAGG或CCTGG序列在第二個C上C5位置上引入甲基修飾作用:宿主細胞通過甲基化作

5、用達到識別自身遺傳物質和外來遺傳物質的目的。（3）限制與修飾系統(tǒng)相關的三個基因①hsdR:編碼限制性內切酶②hsdM:編碼限制性甲基化酶③hsdS:編碼限制性內切酶和甲基化酶的協(xié)同表達這類酶能識別DNA分子上的特定位點，并將雙鏈DNA切斷這類酶使DNA分子特定位點上的堿基甲基化，即起修飾DNA的作用。作用是協(xié)同上述兩種酶識別特殊的作用位點。2.入噬菌體長期生長在大腸桿菌宿主細胞K株，B株中，1）宿主細胞甲基化酶，將染色體DNA和噬菌體DNA特異性保護.2）封閉自身所產生的核酸內切酶的識別位點------（修飾）1.大腸桿菌宿主細胞K株，B株，有各自的限制

6、和修飾系統(tǒng)。限制和修飾作用的分子機制3.外來DNA入侵時，遭到宿主限制性內切酶的特異降解------（限制）4.由于降解不完全，外來少數(shù)DNA分子在宿主細胞中繁殖過程中被宿主細胞的甲基化酶修飾，雖然是外來卻不被降解。5．接受了新宿主菌甲基化修飾的同時，喪失了原宿主菌修飾的標記，喪失在原宿主細胞中的存活能力?；蚬こ讨?，應采用缺少限制作用的菌株作為受體。1、限制-修飾系統(tǒng)2、限制性核酸內切酶的命名和類型3、II型限制性核酸內切酶的基本特性4、影響限制性內切酶活性的因素5、限制性內切酶對DNA的消化作用第一節(jié)限制性核酸內切酶1973年H.OSmith和D.N

7、athans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：限制性內切酶的命名用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名，組成酶的基本名稱。大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示2.如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將該菌株名的第一個字母加在基本名稱后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質粒上，則用一個大寫字母表示此染色體外遺傳成分。如HindⅡ：d菌株EcoRI：抗藥性R質粒3.如果一種特殊的菌株內有幾種不同的限制與修復系統(tǒng)，用羅馬字母表示該菌株中發(fā)現(xiàn)某種酶

8、的先后次序。如HindⅡ：d菌株中發(fā)現(xiàn)的第二個酶4.所有的限制酶，除以上名稱外還