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1、朱星星：Toll樣受體信號影響精子運(yùn)動(dòng)的機(jī)制Toll樣受體信號影響精子運(yùn)動(dòng)的機(jī)制MechanismsofToll—likereceptorinaffectingmousespermmotility研究生：朱星星導(dǎo)師：龔衛(wèi)娟教授，周洪教授揚(yáng)州大學(xué)二零一四年五月?lián)P州大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文2Toll樣受體信號影響精子運(yùn)動(dòng)的機(jī)制YIllll2Ulll6IH3Ill2113I
2、0114II中文摘要生殖道感染是引起男性不育及女性不孕的最重要原因之一，而感染能啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答。Toll樣受體(TLR)作為固有免疫系統(tǒng)的重要分子，在固有免疫系統(tǒng)抵抗外界干
3、擾方面發(fā)揮著重要作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)TLR表達(dá)于作為生殖細(xì)胞的精子中，而精子運(yùn)動(dòng)被認(rèn)為是成功受孕的關(guān)鍵。為了探索TLR信號對精子生物學(xué)功能的影響，我們首先觀察了不同TLR激動(dòng)劑對精子運(yùn)動(dòng)的影響，發(fā)現(xiàn)TLR激動(dòng)劑能夠顯著抑制精子運(yùn)動(dòng)。本課題擬深入研究TLR信號影響精子運(yùn)動(dòng)的具體信號通路，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究TLR信號通過影響精子的何種生物學(xué)過程最終導(dǎo)致了精子運(yùn)動(dòng)減慢。研究內(nèi)容分為3個(gè)部分：1．不同種類的TLR激動(dòng)劑對精子生物學(xué)性能的影響目的：觀察不同病原組分的TLR激動(dòng)劑對小鼠精子運(yùn)動(dòng)的影響，并初步探討TLR激動(dòng)劑抑制精子運(yùn)動(dòng)的可能原因
4、。方法：采用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法分析不同TLR在精子中的表達(dá)。利用計(jì)算機(jī)輔助精子分析(CASA)的方法觀察不同TLR激動(dòng)劑與小鼠精子孵育6h后的精子運(yùn)動(dòng)情況以及TLR激動(dòng)劑處理不同時(shí)間對正常人精子運(yùn)動(dòng)的影響。利用流式細(xì)胞術(shù)的方法觀察TLR激動(dòng)劑處理6h后的小鼠精子凋亡情況。結(jié)果：除了TLR3表達(dá)量極低之外，其它的TLR在精子中均有表達(dá)。在TLR激動(dòng)劑處理小鼠精子6h后，除了TLR3所對應(yīng)的激動(dòng)劑poly(I：C)對精子運(yùn)動(dòng)沒有影響，其他TLR激動(dòng)劑均能不同程度地抑制精子運(yùn)動(dòng)。另外，TLR激動(dòng)劑抑制精子運(yùn)動(dòng)具有時(shí)間依賴性，Zymosan與L
5、PS均只能在處理6h后才有效抑制精子運(yùn)動(dòng)，而R848在作用精子2h后即有抑制效應(yīng)。與對照組相比，TLR激動(dòng)劑在6h之內(nèi)不能有效地促進(jìn)精子凋亡的發(fā)生。結(jié)論：TLR激動(dòng)劑能夠有效抑制精子運(yùn)動(dòng)并且該效應(yīng)并不由TLR激動(dòng)劑促進(jìn)精子凋亡引起的。2．TLR信號影晌精子運(yùn)動(dòng)的通路研究目的：探索TLR信號影響精子運(yùn)動(dòng)的確切信號通路方法：利用MyDS8敲除小鼠研究TLR激動(dòng)劑對該種小鼠精子運(yùn)動(dòng)的影響。使用LPS處理小鼠精子2h，4h，6h，提取蛋白，通過Western-blotting觀察小鼠精子IRAK，P13K，GSK3a，AKT,GSK313，ER
6、K,p65等分子磷酸化水平的變化，同時(shí)使用IRAK，P13K，朱星星：Toll樣受體信號影響精子運(yùn)動(dòng)的機(jī)制3MEK／ERK．NF—r．B等分子的抑制劑處理小鼠精子半小時(shí)后再給予TLR激動(dòng)劑刺激，CASA觀察信號通路被抑制精子運(yùn)動(dòng)的改變。使用P13K抑制劑處理小鼠精子，Western．Blotting觀察AKT及GSK3a磷酸化水平的變化。結(jié)果：TLR激動(dòng)劑對MyD88敲除小鼠的精子運(yùn)動(dòng)無影響。TLR激動(dòng)劑處理小鼠精子后可觀察到IRAK，P13K，GSK3a等分子磷酸化水平隨處理時(shí)間的延長而上升，而AKT,GSK3p，ERK，p65等分子
7、的磷酸化水平無明顯變化。IRAK或P13K通路被抑制后TLR激動(dòng)劑不再能夠顯著抑制精子運(yùn)動(dòng)，而ME列ERK，NF．r．B通路被抑制后TLR激動(dòng)劑依然能顯著抑制精子運(yùn)動(dòng)。P13K抑制劑處理小鼠精子后，AKT的磷酸化水平?jīng)]有顯著改變而GSK3a的磷酸化水平受到了顯著地抑制。結(jié)論：TLR信號以MyD88／IRAK4／P13K及GSK3a依賴而非AKT依賴的信號通路途徑抑制精子運(yùn)動(dòng)。3．TLR信號影響精子的生物學(xué)過程研究目的：探討TUt信號通過影響精子的何種生物學(xué)過程最終抑制了精子運(yùn)動(dòng)，并將深入分析TLR信號通路在影響該生物學(xué)過程中的作用。方法
8、：利用熒光素酶反應(yīng)的方法檢測TLR激動(dòng)劑處理6h后小鼠精子ATP水平的變化，進(jìn)而使用基因敲除小鼠分析TLR激動(dòng)劑引起的精子ATP水平的變化是否依賴MyD88及P13K。采用FlF。ATPaseELISA檢測試劑盒檢測TLR激動(dòng)劑處理6h后正常人精子FlF。ATPase的活性變化。利用JC．1線粒體膜電位檢測試劑盒通過流式細(xì)胞術(shù)檢測TLR激動(dòng)劑處理不同時(shí)間對小鼠精子膜電位的影響，并利用Western．blotting分析相關(guān)信號通路分子在TLR激動(dòng)劑處理后轉(zhuǎn)移到線粒體的情況。結(jié)果：與對照組相比，TLR激動(dòng)劑處理后顯著降低了小鼠精子ATP水
9、平，并且TLR激動(dòng)劑不能引起MyD880及pik3cd乒小鼠精子ATP水平的變化。TLR激動(dòng)劑處理6h后能夠引起正常人精子FlF。ATPase活性的顯著上升，并以時(shí)間依賴的方式降低小鼠精子線粒體膜電位。最后
