偽狂犬抗體檢測(cè).ppt

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1、實(shí)驗(yàn)六、偽狂犬抗體檢測(cè)（阻斷ELISA)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈧慰袢目贵w檢測(cè)方法；掌握ELISA的原理和類型；掌握阻斷ELISA檢測(cè)方法的操作程序。二、實(shí)驗(yàn)原理抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性；抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在。單抗血清？底物顯色阻斷ELISA酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀包被緩沖液：0.025MpH9.6碳酸鹽緩沖液豬偽狂犬病毒（PRV）——抗原樣品稀釋液：pH7.4PBS三、實(shí)驗(yàn)材料陰性

2、對(duì)照（EP管中，已稀釋）陽(yáng)性對(duì)照（EP管中，已稀釋）樣品——待測(cè)豬血清（EP管中，已稀釋）HRP標(biāo)記豬PRV單抗——酶標(biāo)單抗（EP管中，已稀釋）洗滌液：含0.05%Tween20的0.01MpH7.4PBS（青瓶）常用酶及底物常用酶底物加終止液前顏色加終止液后顏色堿性磷酸酶（AP）鄰苯二胺（OPD）橙黃色棕黃色辣根過(guò)氧化物酶（HRP）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）藍(lán)色藍(lán)色底物緩沖液：pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液底物溶液：TMB（四甲基聯(lián)苯胺），底物緩沖液，30%H2O2，新鮮配制終止液1.抗原的處理：2.包被抗原：取酶標(biāo)板，加入100μL/孔的抗原稀釋液4℃

3、，18h取出包被好抗原的酶標(biāo)板（4孔/組），甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次四、實(shí)驗(yàn)方法3.加待測(cè)血清：標(biāo)記各孔，加入相應(yīng)液體100μL/孔1234陰性待測(cè)陽(yáng)性待測(cè)4.加酶標(biāo)單抗：37℃，30min甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次各孔加入酶標(biāo)單抗100μL/孔37℃，30min5.顯色：甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次加入底物液A和B各一滴（約50μl）避光顯色10min，加終止液一滴6.觀察結(jié)果取稀釋好的被檢血清2份和陰、陽(yáng)性對(duì)照血清，每孔加入100μl，置37℃溫

4、育30分鐘。洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液200μl，靜置3分鐘倒掉，再在吸水紙上拍干，重復(fù)3次。每孔加酶標(biāo)單抗100μl，置37℃溫育30分鐘。洗板：同步驟2。顯色與終止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50μl)，混勻，室溫（18-25℃）避光顯色10分鐘后。終止：每孔加終止液1滴(50μl)（0.25%氫氟酸），終止反應(yīng)。10分鐘內(nèi)測(cè)定結(jié)果。采用波長(zhǎng)630nm的酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。結(jié)果判定：試驗(yàn)成立的條件是：陰性對(duì)照孔平均OD630值與陽(yáng)性對(duì)照孔平均OD630值之差≥0.3。S=樣品孔OD630值，N=陰性對(duì)照孔OD630值如果S

5、/N比值≤0.35，樣品判定為PRV抗體陽(yáng)性。如果S/N比值≤0.4但>0.35，樣品重測(cè)。如果S/N比值>0.4，樣品判定為PRV抗體陰性。五、結(jié)果與分析陰陽(yáng)性對(duì)照樣品的OD630＝?S/N＝?，被檢血清是陰/陽(yáng)性？結(jié)果與預(yù)期的不符，可能的原因是什么？預(yù)期結(jié)果陽(yáng)性：無(wú)色陰性：藍(lán)色1234陽(yáng)性陽(yáng)性陰性被檢血清？底物顯色被檢？？單抗ELISA實(shí)驗(yàn)前血清樣品盡量做到56℃滅活30分鐘。在ELISA的整個(gè)操作過(guò)程中，洗滌是非常重要步驟，目的在于防止重疊引起非特異性吸附，洗滌時(shí)盡可能除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)，用力甩干。加入底物液后應(yīng)室溫避光，結(jié)果判斷須在10分

6、鐘內(nèi)。實(shí)驗(yàn)中保持安定，不要隨意走動(dòng)、討論不相關(guān)的事情。六、注意事項(xiàng)顯色間接ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反應(yīng)板)表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在。間接法（IndirectELISA）阻斷法（BlockELISA)雙抗體夾心法（SandwichELISA)競(jìng)爭(zhēng)法（CompetitiveELISA)（1）間接法測(cè)定抗體A.將抗原吸附于固相載體表面；B.加抗體,形成抗原-抗體復(fù)合

7、物;C.加酶標(biāo)抗體；D.加底物。測(cè)定底物的降解量＝抗體量。（2）阻斷法測(cè)定抗體A.將抗原吸附在固相載體表面;B.先加待檢血清（抗體）,形成抗原-抗體復(fù)合物;C.再加酶標(biāo)單抗；D.加底物。（3）雙抗體夾心法測(cè)定抗原A.將抗體吸附于固相表面;B.加待檢抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物;C.加酶標(biāo)抗體;E.加底物。底物的降解量＝抗原量。（4）競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原A.抗體吸附在固相載體表面;B.同時(shí)加入酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體；對(duì)照只加入酶標(biāo)抗原；C.加底物。對(duì)照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。思考題間接ELISA和阻斷ELISA有什么異同？哪種方法要好一

8、些，為什么?偽狂犬的抗體檢測(cè)方法有哪些？原理是什么？