用異硫氰酸苯酯.doc

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1、用異硫氰酸苯酯（PITC）與待分析多肽的N-端氨基在堿性條件下反應(yīng)，生成苯氨基硫代甲酰胺（PTC）的衍生物，然后用酸處理，關(guān)環(huán)，肽鏈N-端被選擇性地切斷，得到N-端氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接著用有機(jī)溶劑將該衍生物萃取出來(lái)，酸作用下，該衍生物不穩(wěn)定，會(huì)繼續(xù)反應(yīng)，形成一個(gè)穩(wěn)定的苯基乙內(nèi)酰硫脲（PTH）衍生物。余下肽鏈中的酰胺鍵不受影響。通過(guò)用HPLC或電泳法分析生成的苯乙內(nèi)酰硫脲（PTH-氨基酸），可以鑒定出是哪一個(gè)氨基酸。每反應(yīng)一次，結(jié)果是得到一個(gè)去掉N-端氨基酸殘基的多肽，剩下的肽鏈可以進(jìn)入

2、下一個(gè)循環(huán)，繼續(xù)發(fā)生降解。以上方法已經(jīng)可以自動(dòng)化。[2]用根據(jù)此原理設(shè)計(jì)出的自動(dòng)分析儀進(jìn)行分析時(shí)，能夠可靠地測(cè)定肽鏈的30個(gè)左右氨基酸殘基序列，最多可以分析50-60個(gè)氨基酸殘基。在最好的條件下，每形成一次PTH-氨基酸，效率可保持在99%以上。而且此法用量少，一般只用10-100皮摩爾的多肽即可測(cè)定氨基酸序列。對(duì)于肽鏈較長(zhǎng)的多肽，可以先將肽鏈切斷成多個(gè)小肽，對(duì)這些小肽進(jìn)行氨基酸分析，然后將這些信息拼接起來(lái)，得到起始肽鏈中的氨基酸序列。由于Edman降解是以化學(xué)試劑對(duì)N-端氨基的修飾為基礎(chǔ)的，因此當(dāng)

3、N-端被其他化學(xué)基團(tuán)所封閉時(shí)，就需要先去除這些基團(tuán)，然后才能進(jìn)行測(cè)序。此外，蛋白質(zhì)中含有半胱氨酸殘基時(shí)，有時(shí)兩個(gè)半胱氨酸殘基會(huì)發(fā)生二硫鍵交聯(lián)。這種情況下，需要先用過(guò)酸將二硫鍵氧化為–SO3H，然后才能用Edman降解測(cè)定序列。