異硫氰酸苯己酯調(diào)控組蛋白乙酰化并誘導(dǎo)molt4細(xì)胞凋亡的研究

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1、異硫氰酸苯己酯調(diào)控組蛋白乙酰化并誘導(dǎo)Molt4細(xì)胞凋亡的研究作者：馬旭東，黃軼群，鄭瑞璣【摘要】目的研究異硫氰酸苯己酯（PHI）對(duì)淋巴母細(xì)胞性白血病Molt4細(xì)胞組蛋白乙酰化調(diào)控及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。方法采用MTT法觀察PHI對(duì)Molt4細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡；olt4細(xì)胞株為模型，研究PHI誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞系白血病細(xì)胞凋亡及其機(jī)制。1材料和方法1.1材料PHI（美國LKTLaboratories公司，批號(hào)：243－264），以75%甲醇配成5mmol/L存儲(chǔ)液。細(xì)胞培養(yǎng)用1640（美國Gibico公司）；胎牛血清

2、（杭州四季青生物制品公司）；AnnexinV和PI雙染試劑盒（美國BD公司）；Bcl2、Caspase3、Caspase9、Caspase8鼠單克隆抗體，PARP、βactin兔多克隆抗體，辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔的二抗，olt4細(xì)胞株（武漢大學(xué)典型物培養(yǎng)中心），用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液置37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。1.2.2PHI對(duì)Molt4細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，將其濃度調(diào)整為1.0×105mL-1接種于96孔細(xì)胞培

3、養(yǎng)板，每孔100μL，對(duì)照組使用75%甲醇，實(shí)驗(yàn)組分別加入PHI使終濃度為0,5,10,20,40μmol/L，每組設(shè)6個(gè)平行孔，培養(yǎng)24,48,72,96h后，每孔加入MTT（5mg/mL）10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心后小心吸去上清，每孔加100μLDMSO，充分震蕩混勻，在酶標(biāo)儀用雙波長492nm和630nm測(cè)吸光度（D值），計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率（%）=（D實(shí)驗(yàn)-D空白）/（D對(duì)照－D空白）×100%實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.3PHI對(duì)Molt4細(xì)胞凋亡的影響用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基接種于75mL培養(yǎng)瓶，每瓶

4、接種2×106細(xì)胞，細(xì)胞濃度為2×105mL-1，加入PHI使終濃度為0,5,20,40μmol/L，作用3,7,14h后收集處理后細(xì)胞。按試劑盒說明書操作后，立即行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。1.2.4PHI對(duì)Molt4細(xì)胞組蛋白乙?；⒌蛲鱿嚓P(guān)蛋白影響細(xì)胞接種濃度及處理同前，收集細(xì)胞后，預(yù)冷PBS0.06mol/L洗滌2次，吸干洗滌液。按每1×106細(xì)胞加入100μL裂解液+1μL酶抑制劑的比例冰上裂解細(xì)胞30min，1000r/min4℃離心10min，吸取中間清亮層。Bradford法進(jìn)行蛋白定量。以10％或12％的SDSPAGE電泳

5、分離，半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，室溫下?lián)u床封閉1h，加入用TBS根據(jù)不同的一抗稀釋不同的濃度，4℃過夜，TBS洗滌液洗膜后分別放入用TBS按1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗以及羊抗鼠二抗，室溫下?lián)u床作用1h，TBS洗滌液洗膜后化學(xué)發(fā)光法顯色，X射線底片曝光，以βactin為內(nèi)參照，X射線膠片掃描后，AlphaDigiDoc圖像分析軟件進(jìn)行分析比較。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理SPSS11.5軟件處理數(shù)據(jù)。常規(guī)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，正態(tài)性檢驗(yàn)。計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示。多組資料之間的比較采用單因素方差分析；方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P&l

6、t;0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1PHI對(duì)Molt4細(xì)胞的增殖有抑制作用不同濃度PHI作用后，Molt4細(xì)胞的增殖率隨藥物濃度的增加及時(shí)間的延長而逐漸下降，表現(xiàn)為明顯的濃度和時(shí)間依賴性。0,5,20,40μmol/LPHI作用后，Molt4細(xì)胞的增殖率隨藥物濃度的增加而逐漸下降，表現(xiàn)為明顯的濃度依賴性；20μmol/LPHI作用后，Molt4細(xì)胞的增殖率隨處理的時(shí)間的增加而逐漸下降，表現(xiàn)為明顯的時(shí)間依賴性（圖1A，B）。2.2PHI能誘導(dǎo)Molt4細(xì)胞的凋亡PHI作用于Molt4細(xì)胞3，7，14h后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)

7、果顯示PHI能誘導(dǎo)Molt4細(xì)胞凋亡，并具有時(shí)間和劑量依賴性（P<0.05，表1）。2.3PHI對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響olt4細(xì)胞3h后，內(nèi)源性途徑的線粒體膜蛋白Bcl2，Caspase9及下游Caspase3凋亡底物PARP表達(dá)下降，而7h下降趨勢(shì)更明顯，呈時(shí)效及量效關(guān)系；而配體受體途徑的Caspase8未見明顯變化（圖2）。表1PHI對(duì)Molt4細(xì)胞早期凋亡的影響2.4PHI對(duì)組蛋白H3、H4乙?；癄顟B(tài)的影響Molt4細(xì)胞在PHI作用下，組蛋白H3、H4乙?；矫黠@增高，呈量效和時(shí)效關(guān)系。僅處理3h即出現(xiàn)組

8、蛋白H3（H3K9，H3K14）、H4（H4K5，H4K8，H4K12，H4K16）乙?；缴?，7h后此變化趨勢(shì)更加顯著，與0μmol/L組比較，H3乙?；謩e增加2.0，2.2，4.0倍。H4乙?；黾?.3，1.